中藥指紋圖譜

以指紋圖譜作為中藥（天然藥物）提取物及其製劑的質量控制方法，已成為目前國際共識，各種符合中藥（天然藥物）特色的指紋圖譜控制技術體系正在研究和建立。美國食品藥品管理局（FDA）允許草藥保健品申報資料中提供色譜指紋圖譜；世界衞生組織（WHO）在1996年草藥評價指導原則中也規定，如果草藥的活性成分不明確，可以提供色譜指紋圖譜以證明產品質量的一致；歐共體在草藥質量指南中亦稱，單靠測定某種有效成分考查質量的穩定性是不夠的，因為草藥及其製劑是以整體為活性物質。色譜指紋圖譜尤其是薄層色譜的鮮明的指紋圖譜是很有用的。國外指紋圖譜的應用，目的在於解決成分複雜，有效成分不明確的植物藥質量檢測和產品批次間質量差異的問題。其中德國研製的銀杏葉提取物製劑是一個突出的例子。他們應用指紋圖譜制定了相應的標準，該圖譜體現了製劑所含的33個化學成分（主要為黃酮類和內酯類）和各自的含量。經化學成分和藥效相關性研究，發現約24%銀杏黃酮和約6%銀杏內酯組成的提取物具有最佳療效。此外，採用“混批勾兑”法，可使最終產品質量穩定，指紋圖譜重現性良好，含量浮動範圍為5%左右。

20世紀70年代我國已有學者嘗試使用TLCS對中成藥進行分析，因主客觀條件的限制，技術和時機的不成熟，沒有得到公認；20世紀90年代《中國藥典》增設了中藥化學對照品和對照藥材，為中藥指紋圖譜的研究奠定了基礎。隨着色譜技術的迅速發展和檢測能力的顯著增強，為指紋圖譜的研究和應用提供了良好的技術保證。目前我國已對中藥注射劑做出了必須用指紋圖譜進行檢測的規定，同時提出了具體的技術要求；在中藥材規範化生產實施過程中指紋圖譜亦有較廣泛的應用。

但是作為一項新技術，中藥指紋圖譜在實際應用中還面臨許多問題，只有進一步加強中藥材種植加工和中成藥生產貯存的規範化；中藥化學成分和中藥藥理研究的系統化和標準化；以及技術上多學科的滲透，才能保證中藥質量的穩定，進而保證中藥指紋圖譜的建立.

中藥及其製劑均為多組分複雜體系，因此評價其質量應採用與之相適應的，能提供豐富鑑別信息的檢測方法，但現行的顯微鑑別、理化鑑別和含量測定等方法都不足以解決這一問題，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其製劑中所含化學成分的種類與數量，進而對藥品質量進行整體描述和評價。這也正好符合中醫藥整體學説。在此基礎上，如果進一步開展譜效學研究，可使中藥質量與其藥效真正結合起來，有助於闡明中藥作用機理。總之，中藥指紋圖譜的研究和建立，對於提高中藥質量，促進中藥現代化具有重要意義。

中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑑定手段，它是建立在中藥化學成分系統研究的基礎上，主要用於評價中藥材以及中藥製劑半成品質量的真實性、優良性和穩定性。“整體性”和“模糊性”為其顯著特點。

中藥指紋圖譜(fingerprinting)是借用DNA指紋圖譜發展而來。最先發展起來的是中藥化學成分色譜指紋圖譜，特別是高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。HPLC具有很高的分離度，可把複雜的化學成分進行分離而形成高低不同的峯組成一張色譜圖，這些色譜峯的高度和峯面積分別代表了各種不同化學成分和其含量。由此可見，中藥指紋圖譜比DNA指紋圖譜更進一步的發展在於：不但有特徵的體現(各種化學成分的個數和相對位置——保留時間)可作定性鑑別使用，還體現了量的概念。峯的高度和峯面積表示了某個化學成分的含量，而各峯的峯高(或峯面積)的比值體現了各種化學成分間的相對含量；量的概念的引入、定性和定量的結合賦予中藥指紋圖譜更大的功效；中藥指紋圖譜不僅可以進行個體、某物種的“唯一性”的鑑定，還可以將其“量”的特徵和其他體系掛鈎。

因此，中藥指紋圖譜不僅是一種中藥質量控制模式和技術，更可以發展成為一種採用各種指紋圖語來進行中藥理論(複雜系統)和新藥開發的研究體系和研究模式。

狹義的中藥指紋圖譜是指中藥化學(成分)指紋圖譜，廣義的中藥指紋圖譜則可按應用對象、測定手段進行不同的分類。

按應用對象分類

中藥指紋圖譜可用於中藥製劑研究、生產過程的各個階段，按應用對象來分類，可分為中藥材(原料藥材)指紋圖譜、中藥原料藥(包括飲片、配伍顆粒)指紋圖譜和中藥製劑指紋圖譜。如分得更細，還可包括用於工藝生產過程中間產物的指紋圖譜。值得注意的是建立中藥材化學指紋圖譜必須考慮諸多因素的影響。中藥品種混雜，歷史上形成的同名異物、異名同物，以及同一物種受產地環境、不同有效部位所含成分的波動大等因素，給質量控制帶來了很多困擾。因此對於某一種中藥材的指紋圖譜，需要有大量的數據積累，才能制定合理的相似性標準。

按測定手段分類

中藥指紋圖譜按測定手段可分為中藥化學(成分)指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。中藥生物指紋圖譜主要是測定各種中藥材的DNA圖譜，由於每個物種基因的唯一性和遺傳性，中藥材DNA指紋圖譜可用於對中藥材的種屬鑑定、植物分類研究和品質研究。它對中藥材GAP基地建設、中藥材種植規範(SOP)、選擇優良種質資源和藥材道地性研究極為有用。

中藥化學(成分)指紋圖譜是指測定中藥材所含各種化學成分(次生代謝產物)而建立的指紋圖譜。雖然化學成分是次生代謝產物，受生物環境和生長年限的影響而產生個體間較為明顯的差異，但植物的代謝具有遺傳性，作為同一物種的個體在化學成分上也具有相似性(similarity)，可以用化學成分的譜圖來建立指紋圖譜。中藥化學(成分)指紋圖譜主要有光譜法和色譜法：如紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜(MS)、核磁共振譜(NMR)，薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)，以及各種聯用技術。中藥材化學指紋圖譜對控制中藥材質量具有更直接、更重要的意義。

指紋圖譜應該具備指紋性，即：（1）專屬性強。指所制訂的指紋圖譜應該是該藥材所獨有的、能與其它藥材相區別的，其反映的化學信息是具有高度的選擇性的；（2）穩定性好。即中藥材的指紋圖譜應該是從某中藥材的多批次中歸納出的共性，圖譜中的共有峯或特徵峯應相對穩定；（3）重現性好。所制訂的指紋圖譜在規定條件下應能再現指紋特徵（如共有峯數目、大小、位置等），其誤差應在允許的範圍內。只有這樣，所制訂的指紋圖譜才具有實用價值。中藥指紋圖譜是藉助於波譜或色譜技術獲得的中藥（主要是植物藥）次生代謝化學成分的光譜圖或色譜圖。

目前，中藥指紋圖譜技術已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認的三種常規分析手段。由於HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快、應用範圍廣等特點；中藥成分絕大多數可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，且積累較豐富的應用經驗。因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術的首選方法。隨着HPLC— MS和GC—MS等聯用技術的應用，中藥指紋圖譜技術更趨完善。

1 薄層色譜法（TLC） 薄層色譜具有選用範圍廣,重現性好等優點，常用於中藥各種成分的鑑別。用固定波長對薄層展開的各斑點作薄層掃描圖譜比目測的層析圖譜更為客觀準確，因而具有更好的指紋鑑別意義。但由於受薄層板的質量和開放式層析系統等外界因素的影響，易引起一定的實驗誤差。

2 氣相色譜法 (GC) 氣相色譜是封閉性色譜，受外界影響較少，具有高性能、高選擇性、高靈敏度等優點，適合於藥材及製劑中揮發性成分指紋圖譜的研究。一般使用質量型檢測器-氫火焰離子化檢測器（FID）。錢浩泉等[5]用氣相色譜法建立了高良薑及其邊緣植物揮發油成分的指紋圖譜。具體應用中多與質譜聯用，不僅具有 GC 的高分離效能，而且兼備了質譜鑑定的高靈敏度和準確性。

3 高效液相色譜法 (HPLC) 高效液相色譜具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測器種類多，穩定性好等特點。不受樣品揮發度和熱穩定性的限制，比氣相色譜法應用範圍更廣，樣品中大多數成分均可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，是構建指紋圖譜的主要方法之一。由於中藥成分的複雜性，構建指紋圖譜一般採用梯度洗脱，因為逐步提高流動相洗脱能力可獲得較多色譜峯，提供更多指紋信息。在考察條件時，要對指標成分和非指標成分都予以考慮，由於藥材中各種成分的吸收波長及對不同檢測器的響應不同，在構建指紋圖譜時也需要加以考慮。實際應用中多使用多種聯用技術，充分利用各檢測器的互補性，從不同角度反映藥材及製劑的全貌，從各種圖譜中得到結構信息。

4 高速逆流色譜法 (HSCCC) 它是目前國際上較新型的液－液分配色譜技術，利用相對移動的兩種互不相溶溶劑，在處於動態平衡的兩相中將具有不同分配比的組分分離。已有報道[6]將 HSCCC應用於生物鹼、黃酮、木脂素、蒽醌等天然產物的分離分析。具有分離效率高，溶劑用量少，無吸附，樣品回收率高,重現性好和適用範圍廣等優點。

5 高效毛細管電泳法 (HPCE) 高效毛細管電泳技術是以高壓電場為驅動，毛細管為分離通道，依據樣品中各組分淌度和分配行為上的差異而實現高效快速分離的新型電泳技術。毛細管電泳的廣泛應用取決於其多變的分離模式，幾乎涉及分析化學中所有的分離對象，小到無機離子，大到蛋白質和高分子聚合物，也能夠分析不帶電荷的中性物質[7]。具有所需樣品少、溶劑消耗少、抗污染能力強、可直接分析水溶液等優點。其中毛細管區帶電泳 (CZE) 和膠束電動毛細管電泳色譜 (MECC) 是中草藥分析中最常見的兩種模式。但該方法的重現性有待提高。

6 紫外可見光譜 (UV) 紫外可見光譜反映不同化學物質的電子共扼體系特徵，具有加和性，對於混合物的鑑別專屬性差，分辨率低，故紫外光譜很少用於指紋圖譜的構建。

7 紅外光譜和近紅外光譜 (IR) 紅外光譜是由分子的振動－轉動能級躍遷產生的光譜，紅外光譜具有高度的特徵性。近紅外光譜法在中藥質量控制方面有較好的應用前景。

8 核磁共振法 (NMR) 從純有機化合物的核磁共振氫譜上可獲得結構信息，包括各類質子的化學位移、數量核偶合關係。核磁共振譜具有高度的重現性和特徵性，易於解析和進一步研究，可評價藥材和中成藥質量的均一性和穩定性。

9 質譜法 (MS) 將中藥提取液置質譜儀中進行電子轟擊電離，可獲得提取液中化學成分的質譜指紋譜，不同中藥提取液所含成分不同，所得質譜圖顯示的分子離子峯及進一步，裂解碎片峯不一致，可供鑑別。

10 X射線衍射法 物質被X射線照射可產生不同程度的衍射現象，只要某一混合物的組成是恆定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特徵圖譜。該法具有圖譜指紋專屬性強，信息量大,所需樣品量小等諸多優點，X射線衍射法在動物類藥材鑑定與辨別中有獨特的優勢[8]。

11 分子生物學法 (DNA) 利用聚合酶鏈反應從不同生物樣品中人工合成 DNA片斷，而這種 DNA片斷的大小、數目可因不同的生物而異，故稱之為 DNA指紋圖譜。該技術具有重複性好、靈敏度高的優點。限制性內切酶片段長度多態性（RFLP）是最常用的構建 DNA指紋圖譜的方法，但該法費時費力，應用受到限制。隨機擴增多態 DNA（RAPD）標記，可以在特異 DNA序列尚不清楚的情況下，檢測DNA的多態性，這是構建中藥指紋圖譜的新方法，具有極好的應用前景。 羅志勇等[9]採用 RFLP技術,分析了人蔘、西洋參基因 DNA指紋圖譜。

隨着分離分析技術的發展，中藥質量研究也由過去“四大鑒別”(基元鑑別、性狀鑑別、顯微鑑別、理化鑑別)發展到反映中藥材全貌的指紋體系，即反映中藥材的多元化學組成特性的化學指紋圖譜和反映生物體 (除礦物、樹脂類外) 特性的基因指紋圖譜，從有效成分和遺傳物質兩方面實現對中藥材的質量控制，為中藥材以及中成藥提供綜合的和可量化的質量評價方法。

中國中藥指紋圖譜的研究已有相當的基礎，最早可以追溯到20世紀60年代，如採用薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜法來描述中藥材主要成分的特徵，這是早期的原始的指紋圖譜，具有直觀、在簡單情況下容易比較差異的優點。隨着分析技術的飛速發展和微電腦的廣泛應用，基於化學計量法的中藥指紋圖譜的研究方法向高效、靈敏、專屬、智能化、聯用型的方向發展，高效液相、高效毛細管電泳、高速逆流色譜、核磁共振、近紅外光譜等新興分析技術的應用和各種數學分析方法的運用，為中藥指紋圖譜的研究與發展提供了廣闊的前景。

紫外光譜法是1995年以前指紋圖譜常用的方法。由於不同中藥所含的不飽和程度有差異，因而導致其紫外吸收曲線的形態、峯位、峯強度亦有差異，以此達到鑑別效果。常用導數光譜及結合各種數學分析法來消除樣品中的一些無關吸收，排除原圖譜中的某些干擾。

紅外光譜又稱分子振動轉動光譜，是一種分子吸收光譜。當樣品受到頻率連續變化的紅外光照射時，分子吸收了某些頻率的輻射，並由其振動或轉動運動引起偶極矩的淨變化，產生分子振動和轉動能級從基態到激發態的躍遷，使相應於這些吸收區域的透射光強度減弱。記錄紅外光的百分透射與波數或波長關係的曲線，就得到紅外光譜。一般的紅外光譜是對整個化合物分子的鑑別，比單純的官能團的化學定性鑑別專一性更強。而中藥材的紅外光譜在本質上與純化合物紅外光譜不同，它是混合物中各個組分紅外光譜的疊加。中藥材各種化學成分只要在質和量的方面相對穩定，並且樣品處理方法按同一要求進行，則其紅外光譜也是應該相對穩定的。因此這樣得到的混合物紅外光譜應該是具有一定的客觀性和可重複性。利用上述原理，不同混合物的紅外光譜各主要吸收峯歸屬，只要在4000-400cm，範圍內比較光譜差異即可。這種差異可以表現在三個方面：一是在某一波數處鑑別雙方只有一方有明顯差異；二是在某一波數內，鑑別雙方的光譜中，吸收峯的形狀和強度都有明顯差異；三是“指紋區”，面貌不同。

近紅外光譜法(NIRS)是一種用於鑑定有機物質十分有用的技術，是中紅外光譜中C-H， N-H，O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波長範圍為780nm-2500nm，而且該光譜取決於粒子大小、多晶型、殘留溶劑、濕度等等因素。因此待測物光譜的鑑定不可能直接與參比物質光譜比較後確定，需要通過一系列樣本的檢測(必須預先知道樣本中相關成分的含量或樣本的定性歸屬)，運用化學計算學手段，建立樣本與信息之間的數學模型。運用該模型即可以對未知樣本(例如新近購進的原藥材或新生產的成品等)進行辨別分析(給出結果：合格與否、含量多少等)。該方法為非破壞性方法，可實現產品的無損檢測，具有檢測速度快，操作簡單，所需樣品少，適宜於液體、固體、粘稠流體的分析及過程控制等優點。但是在進行定性定量分析中必須採用一定的數據處理，需要掌握一定的化學計量知識。

中藥注射劑常含熒光性物質，但因不同注射劑所含具體熒光性物質不同，同種注射劑又因廠家的具體配方的差異或製備工藝條件的波動，均會使其特徵的熒光激發、發射光譜不同或其強度呈現差異；根據注射劑的熒光圖譜的差異達到快速鑑別、認定和控制配方、工藝的目的。

熒光光譜不像紅外光譜那樣具有明顯的指紋特徵，但具有高靈敏度的顯著優勢，且差異更為一目瞭然，易於判斷，因此，可以作為紅外光譜指紋技術的一種補充，用於中藥注射液的鑑別和認定，以及生產工藝的控制和成藥熱穩定性研究等。

色譜指紋圖譜最實用、應用也是最廣泛。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑑別手段，是當前符合中藥特色的評價中藥真實性、穩定性和一致性的質量控制模式之一。色譜指紋圖譜最大的優點是具有分離的功能。

TLC為傳統的定性、半定量分析方法，在中國“七五”、“十一五”及“九五”公關課題中有大量採用薄層色譜法進行地道藥材的定性鑑別。該法操作簡單、分析速度快速、一次分析樣品多，提供信息量大，用固定波長對薄層展開的各個斑點進行掃描，所得掃描圖譜比目測的層析圖譜更加客觀準確，因此具有較好的指紋鑑別意義。其最大的缺點是重現性以及精密度差，所以在指紋圖譜應用中受到限制，但可以作為中藥指紋圖譜研究的借鑑和補充。

中藥指紋圖譜技術

GC最適合於各種主含易揮發性成分藥材及其製劑的分析，尤其是毛細管氣相色譜法，分辨率很高，往往一個色譜可以分出百個成分。該法靈敏度高、分離度好，分析速度快，但是分析範圍只是侷限於低沸點成分，是指紋圖譜研究的主要方法之一。

HPLC適用於成分複雜而不易分離的分析對象，具有分離效能高，靈敏度高，分析速度快，不需要氣化，檢測手段多等優點，是目前指紋圖譜技術中用途最廣泛的一種方法。

HSCCC是當前國際流行的新型的液-液分配技術。應用動態液一液分配原理，利用相對移動互不混溶的兩相溶劑，在處於動態平衡的兩相中將具有不同分配比的樣品組分離。其特點是不用固相載體作固定相，克服了樣品吸附、損失、峯形拖尾問題。操作更為簡便，容易掌握。對樣品的預處理要求低，僅需一般粗提物即可。該技術的回收率高，能實現梯度操作，亦能重複進樣，在中藥質量分析控制研究中，尤其在指紋圖譜研究中有較好的應用前景。

毛細管電泳(CE)又叫高效毛細管電泳(HPCE)，以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現分離的電泳分離分析方法，是近年發展起來的一種新的分離技術，是電泳技術和層析技術結合的產物，兼有高壓電泳的高速高分辨率及HPLC的高效率等特點，其選擇性與高效液相有很大的互補性。因此在指紋圖譜研究方面的應用越來越廣泛。

聯用技術 由於中藥複方製劑成分複雜，現行的各種單一測定方法給出信息少均無法建立較完善的指紋圖譜，因而有人提出建立多維指紋譜嘗試解決這一問題。所謂多維，即採用多種分析儀器聯用的模式來測定指紋圖譜，各譜圖間相互補充信息，可對複雜供識品有更清晰完整的認識。目前最常用的是高效液相（或氣相色譜）/二極管陣列檢測器/質譜/質譜聯用方式 (HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS) 所得的多維指紋圖譜。多維譜的建立既能較系統、較完整地解決中藥複方製劑質量控制的難題，又為中藥研究中缺乏標準品的難題提供了種新的解決途徑。除了手性化合物外，從概率上要找出4個或以上圖譜信息完全相同的化合物幾乎是不可能的。

當某一物質進行衍射分析時，該物質被X射線照射而產生不同程度的衍射現象。可分為單晶X衍射法與粉末X衍射法。物質組成、晶型、分子內成鍵方式、分子的構型等決定該物質產生特有的衍射圖譜。如果該物質是一混合物，X-射線衍射圖是各混合物各組分衍射效應的疊加。只要這一混合物的物質組成是恆定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特徵圖譜。X -衍射指紋圖譜具有指紋性強，圖譜穩定可靠等特點。尤其是X衍射Fourier譜分析法可用於動物類藥材的鑑定與偽品識別。

核磁共振氫譜(1H-NMR)是鑑定有機化合物結構的重要的方法之一。它可以獲得化合物的包括各類質子的化學位移、數量、偶合關係等多個結構信息。如可以用一定程序獲取植物類中藥的特徵性化學成分(或化學成分組)的總提取物，同時這些特徵的化學成分的含量是相對固定的，則在規範的提取分離條件下，植物類中藥的1H-NMR圖譜與植物品種存在着嚴格的對應關係，沒有混淆的可能性。圖譜中的信號強弱反映了混合物中各組分的相對含量。在對特徵總提物進一步分離得到單體後，通過結構鑑定和NMR研究，可以對指紋圖譜中的各特徵譜線進行歸屬。

分子生物指紋圖譜

隨着分子生物學技術的迅速發展，DNA分子技術己越來越多的用於中藥材品種鑑別的研究。分子生物指紋圖譜是指採用分子標記技術得到的某一中藥材品種的DNA指紋圖譜。如對於人蔘、西洋參一類中藥材的鑑別，用傳統的方法(性狀、顯微、理化等鑑別方法)都顯片面性，結果往往很模糊，因而其產地、生長年限、加工方式等因素與其性狀和成分不呈很強的相關性，但應用分子生物學技術可以迎韌而解。

指紋圖譜的特徵信息的分析與提取又稱作數據挖掘。中藥指紋圖譜形象地反映了藥用植物物種具有遺傳特性的次生代謝“共有特徵”，又由於次生代謝中地域、生長環境、採收等多種不定因素影響，具有統計學中多元隨機分佈的“模糊性”。數據挖掘技術就是利用模糊數學、統計學、計算機技術等建立一種同時反映這兩種特徵的方法，即從中藥指紋圖譜數據信息庫中提取隱含的及有潛在應用價值、最終可理解的模式的過程。它是發現和解析中藥指紋圖譜潛在信息的有力工具，目的是評價和控制中藥質量及研究中藥定量組效關係(quantitative composition-activity relationship，QCAR)；包含三個過程；

中藥指紋圖譜

指紋圖譜的信息化

指紋圖譜信息化包括數據的獲取和數字化。主要過程為針對某類樣品和要求，確定合適的獲得指紋圖譜的分析方法(如色譜或光譜等)，建立整個分析方法的各種操作條件，進行測試，以獲得不同樣品的指紋圖譜，即數據的獲取。對所得指紋圖譜進行分析，確定其數字特徵。如對紅外指紋圖譜、可用峯的波數和強度作為其數字特徵來表示某個峯。

指紋圖譜知識化

獲得信息化後的指紋圖譜，需要研究如何來利用這些信息，即實現指紋圖譜知識化。指紋圖譜知識化包括信息解讀、比較和判斷，化學信息和藥效信息相關性研究和信息的利用，即從大量指紋圖譜數據中得到有關規律和知識。採用的方法有聚類分析、模式判別、關聯度分析、人工神經網絡等。

聚類分析就是根據一定的規律和要求，對研究的對象進行分類。其基本思路是用“相似度”來衡量樣品之間的親疏程度，並以此來實現分類。通常將相似度大的樣本歸為一類，相似度小的樣本歸為不同類。對於不同批次的中藥樣品其色譜指紋圖經計算機快速辨識處理可依據樣品批與批之間的相似度，確定中藥樣品批間的穩定性。

模糊聚類分析的基本步驟如下：

A. 計算樣品之間的相似度，並將其構成模糊相似關係矩陣R。在由m個己量化的指紋特徵組成的m維空間中，可用多種方法定義樣品之間的相似度。如：相關係數法、最大最小法、算術平均最小法、幾何平均最小法、絕對指數法、廣義夾角餘弦法、馬氏距離法、歐氏距離法等。

B. 用上述方法建立起來的模糊相似關係矩陣R，只有自反性和對稱性，而沒有傳遞性，需要將模糊相似關係矩陣R改造為模糊等價關係矩陣R`，再進行分類。

C. 取一定M值，作等價矩陣的截矩陣，依據取值的不同得到動態聚類譜系圖。

模式判別的基本思路是先建立標準樣本模式的色譜指紋圖譜，然後對未知模式(待鑑定樣品)色譜指紋圖譜進行計算機解析，依據其與標準樣本模式的“隸屬度”、判別未知模式的真偽及優劣。

眾所周知，衡量藥品質量的終極標準是藥效。採用化學分析方法控制藥品質量是一種間接的質量控制手段。一般來説，西藥是成分單一的化合物或化學成分明確的混合物，這些化學成分的性質和數量決定了藥品的療效，因此定性和定量地控制這些化學成分就可全面地控制藥品的內在質量。但中藥與西藥不同，中藥相當於一個大複方，其成分多而複雜，大部分中藥的化學成分不完全明確，某些已知成分並不能代表中藥的全部療效，因此傳統的質量控制模式即單一成分的定性與定量難以控制藥品質量。就中藥指紋圖譜而言，也存在着指紋圖譜與藥效相脱節的問題。所謂關聯度，是指兩個系統或兩個因素間關聯性大小的量度。關聯度描述了系統發展過程中因素間相對變化的情況。如果兩者在發展過程中相對變化基本一致，則認為兩者關聯度大；反之，兩者關聯度小。

隨着模式識別理論的發展，人工神經網絡的實踐也得到了迅速的提高，在諸多領域都有廣泛應用。1990年以來，人工神經網絡在中藥研究領域逐漸得到了應用。與經典模式識別相比，神經網絡法更接近人腦思維過程，具有自組織性和容錯性的優點。神經網絡的結構和學習算法已有很多種，在中藥指紋圖譜中用到的主要有BP(反向誤差傳播)，自適應神經網絡(ART)，自適應線性機(MBL)及模糊神經網絡(FANN)。

實現指紋圖譜知識化的方法還包括峯重疊法、夾角法、決策樹，遺傳算法及近鄰算法等。近來又出現了幾種相似度計算的方法。

中藥方劑指紋圖譜智能數據庫

將從藥材、中間體直至最終產品的大量指紋圖譜彙集成數據庫，採用數學方法比對等，就能確定各個峯之間的相關性，從而做到對整個生產過程實現“全過程質量管理”，而對基礎研究和新藥開發，則可實現全過程化學成分羣的表徵。再加上多維信息(HPLC/PDAD/MS/MS)的指紋圖譜，對整個研究而言存在大量信息需要處理，建立指紋圖譜智能數據庫，就能較好的解決此類問題。

當前，中藥指紋圖譜技術在世界已成為一種發展趨勢。首先是美國食品與藥品管理局（FDA）允許草藥保健品申報資料可以提供色譜指紋圖。世界衞生組織（WHO）在1996年草藥評價指導原則中也規定：如果草藥的活性成份不明，可以提供色譜指紋圖譜以證明產品質量的一致。歐共體也將色譜指紋圖譜監控技術應用於植物藥質量控制。中國專業技術人員對中藥指紋圖譜進行了較早的研究。例如廣州市藥品檢驗所、北京大學、瀋陽藥科大學、陝西師範大學、陝西中醫藥研究院等科研單位均已從不同角度、不同層面對中藥指紋圖譜技術作了深入研究，有些技術已在實踐中得到了應用。

中藥指紋圖譜技術是符合中醫理論及現狀的較好的質量控制技術。因為它並不需要詳細瞭解藥物的具體活性成份信息，只需要瞭解個別指標性活性組分信息，以指標性成份峯作為標記，結合非指標成份進行比對，用來綜合評價藥物質量，既符合中醫藥理論的整體觀點，也滿足了對中藥質量的可控、保證其療效的要求。

運用中藥指紋圖譜和指標成份定量相結合的方式，既可以完善表述中藥的整體性特徵，又別於西藥單一成份定量的質量控制模式，要根據中國的國情，建立自己的中藥質量控制體系，評價體系，儘快建立一支高水準、高素質的科研院所和專業技術隊伍，使中藥指紋圖譜技術得以推廣和應用。

中藥指紋圖譜是用多學科交叉、綜合技術手段對複雜物質組成體系，質量穩定性進行評價的檢測方法。又是分析科學、中藥學、分離科學以及化學、生物信息學等二級學科交叉，綜合應用研究的結果，是中藥現代質量標準體系的核心技術之一，又是解決藥品質量控制和監督這一關鍵問題而採取的一種方法。通過相似性和相關性比對，發展質量變異和缺陷，從而全面特異地把握住中藥的質量命脈。又為中藥新藥研發帶來了一種嶄新的研究模式，從整體綜合的角度把握住了藥物多靶點作用及針對性，為新藥發現和快速篩選提供了思路和方法。

中藥指紋圖譜技術主要體現了信息獲取、信息處理、信息挖掘三方面的內容。具體的講，就是從中藥物質基礎的角度出發，運用現代分離分析科學的手段，獲取中藥化學指紋圖譜。結合藥效研究和相關物質成份的分離鑑定，經效譜關係研究，獲取中藥藥效組分指紋圖譜，並將已取得的指紋圖譜用於中藥材，中間體和中藥複方製劑的質量控制，以及創新藥物研究的實踐中，最終解決中藥質量評價的科學性和關鍵問題；解決制約中藥發展，走向國際市場的瓶頸問題。

中藥指紋圖譜質控技術又與GAP基地建設，SOP質量管理息息相關。中藥生產標準化是中藥產業現代化發展的基礎和關鍵，而中藥指紋圖譜技術又是中藥現代化建設的主要技術手段之一，對中藥“安全、有效和質量可控”，保證物種的延續，遺傳基因的穩定性，品種的地道性和藥用價值起着至關重要的作用。

在實際應用中，中藥指紋圖譜還面臨許多問題，主要有四點：一是中藥來源的混亂無序，指紋圖譜研究首先需要解決這個源頭問題。中藥材作為一種天然產物，受品種、產地、生長環境、種植管理、採收期、炮製加工方法等多種因素影響，難以控制，不同藥材其指紋圖譜有一定的差異，不利於指紋圖譜的應用。因此在制定標準指紋圖譜時，所選取的藥材來源及成藥的工藝應相對穩定，有足夠的代表性，同時保證質量，才能保持標準指紋圖譜的先進性和代表性；二是新技術的應用還不夠前沿，對於中藥這樣一個複雜體系，需要解決分離與檢測兩大問題，而採用單一分離模式勉為其難，採用傳統的檢測手段或單一聯用技術也易丟失大量信息；三是由於實驗室條件，儀器設備的不同造成指紋圖譜差異，從藥材提取分離到分析檢測全過程的標準化、規範化程度不夠，影響實驗室之間的重現性，難以推廣。應在實驗條件和儀器進行規範的條件下建立“標準圖譜”；四是對大量信息的化學計量處理方法還不夠完善，指紋圖譜的特徵性不夠明確具體，指紋圖譜與藥理作用的相關性缺乏研究。在藥理方面，隋因等用血清指紋圖譜研究紅花對豚鼠離體心臟的作用，為研究中藥複方有效化學成分與藥理學之間的聯繫，提供了思路。

隨着現代分析技術的發展，指紋圖譜技術是當今國際公認的控制中藥質量的質控模式。它能從原藥材的栽培、引種，中成藥生產工藝的規範與優化，到產品質量標準的制定提供全方位的質量保證。近年來國外對草藥產品的質量評價也在提倡指紋圖譜[1，2]，隨着各種分析技術的創新和提高以及計算機應用技術的不斷髮展，世界各國對天然藥物的瞭解和研究在不斷深入，中藥指紋圖譜技術在國內外已成為一種發展趨勢,其研究的方法和技術更趨成熟完善，成為國際公認的控制中藥和天然藥質量最有效的方法和手段。日本漢方藥在20世紀80年代就採用高效液相指紋圖譜控制質量[3]。歐共體也將指紋圖譜監控技術應用於植物藥質量控制，美國食品藥品管理局允許草藥保健品申報資料時提供色譜指紋圖。世界衞生組織在 1996 年草藥評價指導原則中也規定：如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖以證明產品質量的一致性。在英國、印度、加拿大等國家在植物藥的研究中，也對指紋圖譜十分重視。在許多國家的藥典中，色譜指紋圖譜已成為主要的分離分析方法。而我國藥典的中藥部分，這一分析技術還未佔主導地位。在醫藥科技“十五”計劃中，重點提出解決中藥材質量規範化問題。2000年國家藥品監督管理局頒佈了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，要求中藥注射劑必須進行指紋圖譜的研究，並建立其相關的標準。規範了中藥指紋圖譜的研究，從而促進了國內近幾年來對指紋圖譜的研究熱潮。而國外許多研究機構對中藥指紋圖譜的研究主要為建立指紋圖譜與藥效的相關性研究，是以中藥理論和新藥開發研究體系為主的模式。我國對中藥指紋圖譜的研究尚處於初級階段，與發達國家相比有一定差距。目前主要為使用各種方法建立中藥材及製劑的指紋圖譜，以及對相應信息進行數字化處理，使其能夠評價和控制中藥材及製劑的質量。