層析技術

層析技術早在1903年就應用於植物色素的分離提取，各種顏色的色素從上到下在吸附柱上排列成色譜，也稱色譜分離法。1931年有人用氧化鋁柱分離了胡蘿蔔素的兩種同分異構體，顯示了這一分離技術的高度分辨力，從此引起了人們的廣泛注意。隨着人們認識和實踐的提高以及物理化學技術的發展，應用範圍更加廣泛，沒有顏色的物質同樣可用此法分離，這時的工作全是使用吸附劑的吸附層析法。自1944年應用濾紙作為固定支持物的紙層析誕生以來，層析技術的發展越來越快。20世紀50年代開始，相繼出現了氣相層析和高壓液相層析，其他如薄層層析、薄膜層析、親和層析、凝膠層析等也迅速發展。在生物化學領域裏，層析技術已成為一項常用的分離分析方法。 ^[2] 

層析法是利用不同物質理化性質的差異而建立起來的技術。所有的層析系統都由兩個相組成：一是固定相，它或者是固體物質或者是固定於固體物質上的成分；另一是流動相，即可以流動的物質，如水和各種溶媒。當待分離的混合物隨溶媒（流動相）通過固定相時，由於各組份的理化性質存在差異，與兩相發生相互作用（吸附、溶解、結合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨溶媒向前移動，各組份不斷地在兩相中進行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達到將各組份分離的目的。

1.按兩相所處狀態分類

2.按層析原理分類

3.按操作形式不同分類

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指混合物隨流動相通過固定相時，由於吸附劑對不同物質的不同吸附力，而使混合物分離的方法。它是各種層析技術中應用最早的一類，至今仍廣泛應用於各種天然化合物和微生物發酵產品的分離、製備。

吸附是表面的一個重要性質，任何兩相都可以形成表面，其中一個相的物質或溶解在其中的溶質在此表面的密集現象稱為吸附。在固體與氣體之間或在固體與液體之間的表面上都可以發生吸附現象。當氣體或溶液中某組分的分子在運動中碰到一個固體表面時，分子會貼在固體表面上並停留一定的時間，然後才離開。這時氣體或溶液中的組分分子在固體表面的濃度就會高於其在氣體或溶液中的濃度。

在液體與氣體之間的表面上，也可以發生吸附現象。凡能將其他物質聚集到自己表面上的物質，都稱為吸附劑。聚集於吸附劑表面的物質就稱為被吸附物。在不同條件下，吸附劑與被吸附物之間的作用，既有物理作用的性質又有化學作用的特徵。物理吸附又稱範德華吸附，因為它是分子間相互作用的範德華力所引起的。其特點是無選擇性，吸附速度快，在相同條件下，吸附過程和脱附過程是同時進行的(可逆的)，因此被吸附的物質在一定條件下可以被解吸出來。在單位時間內被吸附於吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內離開此表面的分子之間可以建立動態平衡，稱為吸附平衡。層析過程就是不斷地形成平衡與不平衡、吸附與解吸的矛盾統一過程。 ^[2] 

各物質在兩相中擴散速度不同，產生不同的分配係數。分配層析分離技術是利用各物質不同分配係數，使混合物隨流動相通過固定相時而予以分離的方法。

分配係數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中的溶解達到平衡時，該溶質在兩相溶劑中所具濃度的比例。不同物質因其性質不同而有不同的比例，也就是有不同的分配係數。現在應用的分配層析技術，大多數是以一種多孔物質吸着一種極性溶劑，此極性溶劑在層析過程中始終固定在此多孔支持物上而被稱為固定相。另用一種與固定相不相溶的非極性溶劑流過固定相，此移動溶劑稱為流動相。如果有多種物質存在於固定相和流動相之間，將隨着流動相的移動進行連續的、動態的不斷分配，由於各種物質的分配係數相近，移動距離就必須相當長才能分開。反之，兩種物質的分配係數相差越大，彼此分開時的移動距離就越短。因此，必須根據實際情況，選定作為固定相用的層析柱或濾紙的長度。

分配層析中應用最廣泛的是以濾紙為多孔支持物的紙上分配層析。其次是以硅膠、硅藻土、纖維素粉、澱粉、微孔聚乙烯粉等多孔支持物的分配層析。還有直接使物質在兩種不相溶的溶劑中進行分配的常壓液相分配層析和高壓液相分配層析。

分配層析以分配係數為依據，在等温等壓條件下可用下式表示。K=K2/K1，式中K為分配係數;K2是物質在固定相中的濃度; K1是物質在流動相中的濃度。分配係數與温度、溶質和溶劑的性質有關，各種物質有不同的分配係數。 ^[2] 

已有近50年的歷史，由於其設備十分簡單、價廉，所需樣品少，分辨力一般能達到要求等優點而被廣泛應用。紙上分配層析可用於物質的分離、定性及定量，對氨基酸、肽類、核苷及核苷酸、糖、維生素、抗生素、有機酸等小分子物質都很適用，但對核酸和蛋白質大分子的分辨力不高。在發酵工業中，常用於菌種篩選階段的物質鑑定。

紙上分配層析是以濾紙為惰性支持物的。濾紙纖維和水有較強的親和力，能吸收22%的水，而且其中6～7%的水是以氫鍵形式與纖維素的羥基結合，在一般條件下較難脱去。而濾紙纖維與有機溶劑的親和力甚弱，所以一般的紙上分配層析實際上是以濾紙纖維及其結合水作為固定相，以有機溶劑作為流動相。當有機相沿紙經過樣品點時，樣品點上的溶質在水相和有機相之間進行分配，一部分溶質離開原點隨有機相移動，進入無機溶質區，此時又重新進行分配，一部分溶質從有機相移入水相。當有機相不斷流動時，溶質也就不斷進行分配，沿着有機相方向移動。溶質中各種不同組分有不同的分配係數，移動速率也不相同，從而使物質得以分離和提純。

溶質在紙上移動的速率可用Rf值表示。 Rf值決定於被分離物質在兩相間的分配係數和兩相間的體積比。由於兩相體積比在同一實驗條件下是一常數，所以Rf值主要決定因素是分配係數，不同物質分配係數不同，Rf值也不同。 ^[2] 

將作為固定相的支持劑 (吸附劑或其它)塗於支持板上(一般為玻璃板) 進行的一種層析技術。如果支持劑是吸附劑，層析時的主要依據是吸附力的不同，應屬吸附層析，又因此種吸附層析是在薄板上進行，故名薄層吸附層析。如果支持劑是纖維素，其層析的主要依據是分配係數的不同，應屬分配層析，因在薄板上進行，故名薄層分配層析。同理，薄板上塗以離子交換劑，分離作用的主要依據為離子交換而名薄層離子交換層析; 薄板上塗以凝膠過濾劑，分離作用主要依據為分子量的大小，而名薄層凝膠層析。

各種薄層層析的原理與其對應的柱層析原理相同，但比其相應的柱層析具有更多的優越性。它同柱層析一樣，可選擇不同的支持劑和不同的處理方法進行薄層層析，它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點。同時，層析速度快，一般僅需15～20分鐘，混合物易分離，分辨力一般比紙上層析高10倍，甚至100倍，它既適用於只有0.01微克(一般用幾十微克)的樣品分離，又能分離大於500毫克的樣品作製備用，而且可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。由於薄層製備利於規格化，重現性也較好，滴加樣品後可立即展層，不受温度等影響，因此發展較快，應用較廣。缺點是對生物高分子物質的分離效果仍然不佳。 ^[2] 

指混合物流動相通過聚酰胺薄膜時，由於聚酰胺與各極性分子產生氫鍵吸附能力的強弱不同，而將混合物分離的方法。

聚酰胺薄膜層析是1966年後發展起來的一種新的層析法，特別是用於氨基酸衍生物(如DNS-氨基酸、DNP-氨基酸)的分析時，此法靈敏度高、分辨力強、操作方便、速度快。在蛋白質化學結構分析中，聚酰胺薄膜層析與Edman-DNS法結合形成一種順序分析的超微量方法。

聚酰胺是一類化學纖維原料，國外稱尼龍，中國稱錦綸，由己二酸與己二胺聚合而成的叫錦綸66; 由己內酰胺聚合而成的叫錦綸6。這類物質分子中都含有大量酰胺基團，故統稱聚酰胺。自1955年發現聚酰胺對極性物質有吸附作用以來，聚酰胺作為氫鍵吸附劑用於柱層析和薄層層析等已有不少報道，而聚酰胺用於薄膜層析則是進一步的發展。目前已應用於16類化合物的分析(酚類、酚類糖苷、醌類、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸鹼基、核苷、核苷酸、雜環化合物、合成染料、磺胺、抗生素、環酮、殺蟲藥、維生素B、抗熱藥物)。

聚酰胺具有特異的層析分辨能力，它對極性物質的分離吸附作用，是由於與被分離物形成了氫鍵。如酚類和酸類是以其羥基與酰胺鍵的羰基形成氫鍵，硝基化合物與醌類是與酰胺鍵的氨基形成氫鍵。被分離物質形成氫鍵能力的強弱，決定了吸附力的差異。在層析過程中，展層溶劑與被分離物質在聚酰胺粒子表面競爭形成氫鍵，可選擇適當的展層溶劑，使被分離物質在溶劑與聚酰胺表面之間的分配係數有最大差異，經過吸附與解吸的展層過程，形成一個分離順序。 ^[2] 

也稱氣相色譜。它與一般層析法的區別主要在於用氣體代替液體作為擴展劑或洗脱劑，因此也同樣有吸附氣體層析法(氣固層析法)和分配氣體層析法(氣液層析法)兩種操作形式。實際應用中以後者為常用。

氣液層析法自1952年發表以來發展迅速，目前已形成了一門獨立的分離分析技術，其應用範圍自石油化學部門擴展到有機、生化、高分子、藥物、無機等領域，凡是可以汽化的或設法保持有揮發性的物質幾乎都可分析。

①氣體粘度小，氣相與液相(固定相)間的質量傳遞率高，容易達到平衡，當使用高的氣相流速時可縮短分離時間，分析常在幾分鐘到幾十分鐘內完成，使用長的層析管能提高分離效率;②檢定氣體中的組分比檢定液體中的組分容易，已有許多簡單與靈敏的儀器可以利用，並可設法使檢定工作自動化，節省人力和時間，它也可與紅外、質譜等組合以提高分析效果; ③氣液層析法中固定相液體的選擇範圍很廣，操作温度範圍也很寬，兩者配合，可將結構相似或沸點相近的物質分開;④檢定器靈敏，樣品用量很少，一般固體樣品只需若干μg至mg;液體樣品量1μl至幾百μl;氣體樣品0.1 ml至10ml。

混合物樣品隨固定流速的載體(常用惰性氣體)進入層析柱。樣品必須是氣態的，如為液態或固態則需先氣化再進入層析柱。層析柱內裝有稱為擔體(樹脂)的顆粒狀隋性支持物，其表面為一類具有高沸點的有機化合物(稱固定液)均勻地包裹着，使擔體表面形成一層很薄的液膜。樣品氣體進入層析柱遇到這種固定液時，就能溶解在固定液中，遇熱又能揮發到載體裏去，並隨載體的定向流動而向前推進，以至又遇到新的固定液而被吸收。如此交替地吸收和揮發，使樣品蒸汽所經過的每一個點上都進行着固定相和流動相之間的分配平衡，由於樣品中各組分在固定液和流動相里的溶解度不同(即分配係數不同)，在層析柱內向前移動的速度也不相同。分配係數大的組分，易溶於固定液內，在固定液中停留的時間就長些，移動的速度也就慢些，分配係數小的組分不易溶於固定液，移動速度就快。經過一段時間後，原來均勻混合的樣品組分彼此就分開了，被分離的組分按先後次序被載體帶入鑑定器，在那裏把進入的樣品濃度轉換成電壓，經放大後在自動記錄儀上記錄下來，得到氣相層析曲線圖。從給樣到每一組分出現在層析峯上的時間稱保留時間，不同化合物在一定條件下有其特定的保留時間。還可根據峯面積來計算各種化合物的濃度。 ^[2] 

又稱高效液相層析(或色譜)。其分離分析原理和經典的液體層析基本相同，但它採用了特有的固定相液體，加上在高壓下工作，又與自動分析儀器相結合，成為一種高效的分析方法。廣泛用於藥物、殺蟲劑、高分子量芳香族化合物、增塑劑、抗生素、各種有機試劑以及核酸、核苷酸類物質的分離分析。

高壓液體層析特點是採用長 (50～100cm) 而細(柱徑2～3mm)的層析柱，柱內填充物的粒度較細(直徑10～15μm)，在高壓下操作，因而分析速度很快。一般可分為以下4類：①液-液分配層析。利用溶質在流動相中分配係數的差別而達到分離的目的，是應用最多的方法之一; ②液-固吸附層析。利用溶質在固體吸附劑上吸附能力的差別，而達到分離目的; ③離子交換層析。通過溶質和擔體的離子交換作用，利用不同溶質離子交換能力的差別，而達到分離目的;④凝膠滲透層析。按溶質分子量大小而分離，也即分子篩層析。

高壓液體層析中常用的擔體是聚苯乙烯凝膠、多孔性二氧化硅微球、多孔玻璃珠等，這些層析擔體對高分子化合物及表面活性劑的分離很有效。 ^[2] 

而按層析原理還可將層析分為：

1.凝膠層析：又稱分子篩過濾或排阻層析等。醫學教育網蒐集整理固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度也不同。本法的優點是所用凝膠屬於惰性載體，吸附力弱，操作條件温和，不需要有機溶劑，對高分子物質有很好的分離效果。常用的凝膠有Sephadex G系列。凝膠層析可用於脱鹽、分離提純、測定高分子物質的分子量、高分子溶液的濃縮等。

2.離子交換層析：採用具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆交換的性質來分離離子型化合物的方法。主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其他帶電荷的生物分子。

3.高效液相層析（HPLC）：在經典液相層析法基礎上，引進氣相層析的理論而發展起來的一項新穎快速的分離技術。具有分離能力強、測定靈敏度高、可在室温下進行、應用範圍廣等優點，對分離蛋白質、核酸、氨基酸、生物鹼、類固醇和類脂等尤其有利，根據流動相和固定相相對極性，高效液相色譜分析可分為正相和反相兩種。

4.親和層析：利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離的目的。將可親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當含混合組分的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質，才能被固定相吸附結合，性無關組分隨流動相流出。改變流動相組分，可將結合的親和物洗脱下來。親和層析中所用的載體稱為基質，與基質共價連接的化合物稱配基。具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體，DNA與互補DNA或RNA，酶與底物、激素與受體、維生素與特異結合蛋白、糖蛋白與植物凝集素等。親和層析可用於純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩定蛋白質的貯藏、分離核酸等。