分子篩層析

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由於它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩衝液洗脱時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先後流出凝膠柱，達到分離的目的。

葡聚糖又名右旋糖酐，在它們的長鏈間以三氯環氧丙烷交聯劑交聯而成。葡聚糖凝膠具有很強的吸水性，交聯度大，吸水性小，相反交聯度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯度越大，吸水性越小，G值越大，交聯度越小，吸水性就越大，二者呈反比關係，G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據牀體積而估算出葡聚糖凝膠乾粉的用量。

表1－8 Sephadex1的種類與特性

G25、G50有四種顆粒型號：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、細（20µ~80µ）和超細（10µ~40µ）。G75～G200又有兩種顆粒型號：中（40µ～120µ），超細（10µ～40µ）。顆粒越細，流速越慢，分離效果越好。

表1－9 DEAE－纖維素與Sephadex1比較

根據層析物質分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除遊離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用於分離蛋白質單體，G200多用於分離蛋白質凝膠聚合體等。

稱取適量的凝膠加入過量的緩衝液在冰箱（或室温）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應根據不同型號的凝膠而定（ ）。

為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子後，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉澱的粒子，如此反覆數次即可。

層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱牀體積應為樣品體積的25～100倍。去鹽、遊離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大於中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對於除鹽來説應為1︰5～1︰25；對於純化蛋白質來説應為1︰20～1︰100。

裝柱過程基本同離子交換層析柱。

樣品體積不宜過多，最好為牀體積的1%～5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。

洗脱液應與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發生變化，影響分離效果。洗脱液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩衝鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。

同離子交換層析。

當樣品的各組分全部洗脱下來之後，即可加入新的樣品，繼續使用。保存方法有三種：

⑴ 在液相中保存最方便，即於凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高壓滅菌後4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

⑵ 用完後，以水沖洗，然後用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態下保存。

⑶ 長期不用者，最好以乾燥狀態保存，即水洗淨後，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最後用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾幹，於60℃~80℃乾燥後保存。