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凝膠過濾層析
鎖定
- 中文名
- 凝膠過濾層析
- 外文名
- gel filtration chromatography
- 別 名
- 排阻層析或分子篩方法
- 歸 類
- 洗脱分離的一項技術
- 分類根據
- 蛋白質的大小和形狀
- 應 用
- 用於分離提純、脱鹽等
凝膠過濾層析基本原理
凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用,根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質,多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質,小分子物質能進入其內部,流下時路程較長,而大分子物質卻被排除在外部,下來的路程短,當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時,溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
凝膠過濾層析優點
凝膠過濾層析使用方法
⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開,由於它們在分配係數上有顯著差異,這種分離又稱組別分離,一般可選用SephadexG-25和G-50,對於小肽和低分子量的物質(1000-5000)的脱鹽可使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離,這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠,層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部,由於Kd不同,最後得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據經驗,組別分離時,大多采用2-30cm長的層析柱,分級分離時,一般需要100cm左右長的層析柱,其直徑在1-5cm範圍內,小於1cm產生管壁效應,大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間,但對移動慢的物質宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的製備凝膠型號選定後,將幹膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脱液中充分溶脹,溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長,加熱可使溶脹加速,即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升温至近沸,1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填:將層析柱與地面垂直固定在架子上,下端流出口用夾子夾緊,柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器,柱內充滿洗脱液,將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中,然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內,這樣凝膠粒水平上升,直到所需高度為止,拆除柱頂裝置,用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠牀表面。稍放置一段時間,再開始流動平衡,流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速,千萬不能超過最終流速。平衡凝膠牀過夜,使用前要檢查層析牀是否均勻,有無“紋路”或氣泡,或加一些有色物質來觀察色帶的移動,如帶狹窄、均勻平整説明層析柱的性能良好,色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脱凝膠牀經過平衡後,在牀頂部留下數亳升洗脱液使凝膠牀飽和,再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總牀體積的5%-10%。樣品濃度與分配係數無關,故樣品濃度可以提高,但分子量較大的物質,溶液的粘度將隨濃度增加而增大,使分子運動受限,故樣品與洗脱液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入後打開流出口,使樣品滲入凝膠牀內,當樣品液麪恰與凝膠牀表面相平時,再加入數毫升洗脱液中洗管壁,使其全部進入凝膠牀後,將層析牀與洗脱液貯瓶及收集器相連,預先設計好流速,然後分部收集洗脱液,並對每一餾份做定性、定量測定。
凝膠過濾層析回收方法
如果不再使用可將其回收,一般方法是將凝膠用水沖洗乾淨濾幹,依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇濃度達90%以上,濾幹,再用乙醚洗去乙醇、濾幹、乾燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性,密封后高壓滅菌保存。
凝膠過濾層析凝膠層析的應用
⑴脱鹽:高分子(如蛋白質、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質,可以用凝膠層析法除去,這一操作稱為脱鹽。本法脱鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脱鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長與直徑之比為5-15,樣品體積可達柱牀體積的25%-30%,為了防止蛋白質脱鹽後溶解度降低會形成沉澱吸附於柱上,一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩衝液使層析柱平衡,然後加入樣品,再用同樣緩衝液洗脱,收集的洗脱液用冷凍乾燥法除去揮發性鹽類。
⑶測定高分子物質的分子量:用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內,在同一條件下層析,記錄每一分鐘成分的洗脱體積,並以洗脱體積對分子量的對數作圖,在一定分子量範圍內可得一直線,即分子量的標準曲線。測定未知物質的分子量時,可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內洗脱後,根據物質的洗脱體積,在標準曲線上查出它的的分子量。