親和色譜

20世紀初，俄國植物學家茨維特（Tswett）首次提出色譜法。他把碳酸鈣粉末裝到玻璃管中，將植物葉子的石油醚萃取液作為樣品倒入管內，然後再用石油醚自上而下洗脱。隨着洗脱的進行，植物葉子中的各種色素向下移動逐漸形成一圈圈的色帶，茨維特將這種色帶分離過程稱為色譜（Chromatography），所用的玻璃管內的碳酸鈣填充物稱為固定相（stationary phase）,洗脱用的石油醚稱為洗脱液或洗脱劑（eluent），也就是我們常説的流動相(mobile phase)。後來，採用該法分離了許許多多的物質，雖然分離過程中看不到色帶存在，但色譜法一直沿用。

色譜法在當今物質尤其是具有生物活性物質的分離中起到舉足輕重的作用。然而在色譜發展的早期有許多的人往往將色譜看做一種藝術（art）, 但是隨着色譜理論的發展，以及色譜技術的不斷推廣，色譜逐漸的稱為了一種科學（science）。對於從事生物大分子分離的物質常常用一句話來形容色譜的重要作用：“色譜技術是當今生物工程下游技術的核心”。當今的色譜法包括分離和檢查兩部分，能夠同時實現分離和分析。色譜法也必定會隨着材料、生物等多學科研究的深入會更加廣泛的應用到分離科學和分析化學之中的。 ^[1] 

將一對能可逆結合和解離生物分子的一方作為配基（也稱為配體），與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯、製成專一的親和吸附劑，再用此親和吸附劑填充色譜柱，當含有被分離物質的混合物隨着流動相流經色譜柱時，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附能與其結合的物質，而其他的蛋白質及雜質不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當的緩衝液使被分離物質與配基解吸附，即可獲得純化的目的產物。

親和色譜分離的通常是混合在溶液中的物質，比如細胞內容物、培養基或血漿等。待分離的分子在通過色譜柱時被固定相或介質上的基團捕獲，而溶液中其他的物質可以順利通過色譜柱。然後把固態的基質取出後洗脱，目標分子即刻被洗脱下來。如果分離的目的是去除溶液中某種分子，那麼只要分子能與介質結合即可，可以不必進行洗脱，再生時調整流動相將雜質洗脱。

親和色譜的用途很廣泛，可以用來從細胞提取物中分離純化核酸、蛋白，還可以從血漿中分離抗體。分離重組蛋白就經常使用親和色譜。通過基因修飾為蛋白加上一些人為的特性，這些特性使蛋白選擇性地與配體結合，從而達到分離的目的。親和色譜的另一大用途是從血漿中分離抗體。

1、上樣體積

若目標產物與配基的結合作用較強，上樣體積對親和色譜效果影響較小。若二者間結合力較弱，樣品濃度要高一些，上樣量不要超過色譜柱載量的5%~10%。（這個載量是指色譜柱所吸附的配體的量）

2、柱長

親和柱的長度需要根據親和介質的性質確定。如果親和介質的載量高，與目標產物（目標物）的作用力強，可以選擇較短的珠子（柱子）；相反，則應該增加柱子的長度，保證目標產物與親和介質有充分的作用時間。

3、流速

親和吸附時目標產物與配基之間達到結合反應平衡需要一個緩慢的過程。因此，樣品上柱的流速應儘量的慢，保證目標產物與配基之間有充分的時間結合，尤其是二者間結合力弱和樣品濃度過高時。

4、温度

温度效應在親和色譜中比較重要，親和介質的吸附能力受温度影響，可以利用不同的温度進行吸附和洗脱。一般情況下親和介質的吸附能力隨温度的升高而下降，因此在上樣時可選擇較低的温度，使待分離物質與配基有較大的親和力，充分地結合；而在洗脱時刻採用較高的温度，使待分離物質與配基的親和力下降，便於待分離物質從配基上脱落。例如，一般選擇在4℃進行吸附，25℃下進行解吸 ^[2]