聚丙烯酰胺凝膠電泳

作用原理：聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

在蛋白質的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質能夠保持完整狀態，並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開；在DNA的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，DNA呈雙鏈狀態泳動，其遷移率會受鹼基組成和序列的影響。

在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，由於加入了變性劑——蛋白質變性劑常為SDS（SDS-PAGE），核酸變性劑常為尿素、甲酰胺等，故其分離僅依據於分子量大小。蛋白質的SDS-PAGE技術最初由shapiro於1967年建立，他們發現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子表面活性劑和強還原劑（SDS，即十二烷基硫酸鈉）後，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。SDS是陰離子去表面活性劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去摺疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS後，分子被解聚成多肽鏈，解聚後的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。

SDS-PAGE一般採用的是不連續緩衝系統，與連續緩衝系統相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCl緩衝液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始後，HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在後面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成一穩定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。

此鑑定方法中，蛋白質的遷移率主要取決於它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。

蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決於它所帶淨電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決於分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發現陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由於十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質-SDS複合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合後，還可引起構象改變，蛋白質-SDS複合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS複合物的短軸長度都一樣，約為18A（1A=10^-10m），這樣的蛋白質-SDS複合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決於分子量的大小由於蛋白質－SDS複合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠後，由於聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯後，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用於測定蛋白質的分子量。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關係，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經常應用於提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應於各個亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關於分子量的情況，這些信息對於瞭解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。

在SDS－PAGE不連續電泳中，制膠緩衝液使用的是Tris－HCl緩衝系統，濃縮膠是pH=6.7，分離膠pH=8.9；而電泳緩衝液使用的Tris－甘氨酸緩衝系統。在濃縮膠中，其pH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而Cl^-離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介於二者之間泳動。由於導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓梯度，壓着蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠後，由於膠中pH的增加，呈鹼性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之後，同時由於分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。

所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之後仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素，當然其他的因素也可以從多方面考慮。

根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

1、還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或β-巰基乙醇）後，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的並經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100μL樣品緩衝液中10μL 20%的碘乙酸胺，並在室温保温30min。

3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白摺疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。

聚丙烯酰胺：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關係到電泳成功與否與促凝劑及環境密切相關；

制膠緩衝液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇Tris－HCl系統。

TEMED與AP：催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。

TEMED四甲基乙二胺，催凝劑，加速AP催化作用。

十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽摺疊。

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。

待凝膠在室温凝固後，可在室温下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，後者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法。

主要是由於凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現於較厚的凝膠中。

處理辦法：待其充分凝固再作後續實驗。

主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除乾淨。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩衝液，以排除氣泡。

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。此外可能是灌膠時分離膠過多導致濃縮膠很少，不能起到濃縮作用，沒有把樣品壓成一條線。

處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩衝液，加適量樣品促溶劑；電泳緩衝液時間過長，重新配製；降低凝膠濃度；灌膠時分離膠不要過多。

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

“鬼帶”就是在跑大分子構象複雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉澱，主要由於還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新摺疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻於目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸後，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩衝液和分離膠的濃度有關。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；

1、聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（以後簡稱單體）在水溶液中聚合而成的親水性高聚物，是一種透明而不溶於水並有韌性的凝膠。

2、製備凝膠時需要的原料是：丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺（雙體，用作交聯劑）在水溶液中用催化劑引發聚合。常用的催化劑有：二甲氨基丙腈（DMAPN）；過硫酸銨，四甲基乙二胺；過硫酸銨或加核黃素後用紫外光（波長253．7毫微米）引發聚合。

3、聚合時丙烯酰胺分子通過加成反應形成長鏈，雙體的作用是在長鏈之間形成交聯，成為具有三維網狀結構的凝膠。所以在凝膠電泳中除了具有電泳的分離外還具有分子篩作用，從而增高了它的分辨能力。

4、聚合時，根據分離的需要，可以用改變單體溶液濃度或增減雙體比例的辦法制成孔度大小不同的凝膠。在分離血清蛋白時，採用的丙烯酰胺總濃度為6.5%，內含單體96%，雙體4.5%。

5、聚合物分子中含有很多酰胺基，所以凝膠具有良好的親水性，能在水中溶脹但不溶解。

1、直流電源如果一次進行電泳的管數在20管以內可以用最大電流300毫安的整流器（硅或硒整流器），調壓範圍0-300V。

2、電泳裝置包括二個緩衝液槽和電泳管。液槽可以用玻璃或塑料製成，在底部鑽孔。插入電泳管，用有孔橡皮塞固定。電泳管選用孔徑均勻一致的玻璃管切制。長10釐米，內徑5毫米。脱色用玻璃管長10釐米，內徑8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。

3、凝膠管架灌裝凝膠管時使管保持垂直位置，用有機玻璃製成。

1、凝膠管的製備將電泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然後灌入新配的凝膠溶液。每管加至液體高度為7.5cm。為了保證凝膠表面平整可用注射器通過細針頭小心地加一層（高約1釐米）蒸餾水於表面上，勿使與凝膠液混合，室温放置。如果條件合適溶液於30-60分鐘內聚合而成凝膠。凝膠溶液的配製方法：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重結晶）25g，雙體（甲醇重結晶）1g，加水配成100mL溶液。必要時用三羥甲基氨基甲烷調pH至7.0。溶液乙：二甲氨基丙腈1mL，三羥甲基氨基甲烷0.85g（也可用0.625g氨三乙醇或氨乙醇）加水至100mL。溶液丙：K₃Fe(CN)₆分析純0.075g，加水至100mL新配。用作阻聚劑以延緩凝聚時間。使操作方便，如凝聚時間已足夠長可以用蒸餾水代替。溶液丁：過硫酸銨（二級）2.8g加水至100mL新配。必要時用氨水調pH至7.0，溶液甲及乙配後可在冰箱中保存數月。溶液丙及丁用時新配。臨用前將溶液甲、乙、丙、丁等量混合。

2、準備把已灌裝凝膠的玻管通過有孔椽皮塞安裝在上面液槽的底孔中，在上下兩槽內分別注入緩衝液。裝上後電泳管下端應浸沒在下槽的緩衝液中，管下端勿留氣泡。血清電泳可以用巴比妥緩衝液pH-8.6，離子強度0.05（配法：巴比妥鈉10.3g，二乙基巴比土酸1.84g，加水至1L，温熱使溶解加硫柳汞0.1g防黴）。

3、在血清樣品中加入少量蔗糖以增加密度，用血紅蛋白吸管直接小心地加在凝膠表面上，加樣量一般為7μL血清。如果在樣品中混入少量溴酚蘭指示劑就可以在電泳過程中觀察前沿移動的情況。

4、電泳在二液槽中安放鉑金絲電極；正極在下，負極在上。接通電源進行電泳，電場強度10V/cm左右，視室温高低而定。室温較高時宜用較低的電壓以免發熱過度影響分離。蛋白質向正極移動。侍染料前沿移動至管底近處，停止電流。電泳時間為1-2小時。電泳完畢取下凝膠管，用細長針頭沿管壁注蒸餾水，使凝膠與管壁剝開。然後用橡皮球壓出凝膠條。

5、染色及脱色電泳後的凝膠條在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定並染色1小時以上。染色後的凝膠條用7%醋酸洗滌數次。置於脱色玻管中，在同一電泳裝置中電解脱色。此時改用7%醋酸充裝在液槽中。通電後過剩凝膠之上再加一層大孔凝膠，樣品聚合在最後的另一層凝膠中。在我們的試驗中省略的染料泳向正極。脱色時電場強度25V/cm，電流10-15mA/管。3-4小時脱色完畢。增高電壓可以加速脱色。有色的醋酸溶液通過盛有活性炭的漏斗過濾，即可除去染料，重新使用。

6、保存與記錄脱色後的凝膠可以裝在盛有7%醋酸的有塞試管中保存數年。也可以自然乾燥後保存，在需要觀察時再浸在7%醋酸中溶脹成原來形狀。記錄可以用照相攝影。也可以用光密度計進行捕記。光密度計的分辨力決定於其狹縫寬窄及光電管放大倍數。

1、電泳條件的選擇

為了選擇血清蛋白電泳較合適的條件，我們分別對單體濃度、雙體濃度、配製凝膠時所用不同正離子、各種電壓、二甲氨基丙腈的濃度、過硫酸銨的濃度等條件進行了試驗。根據以上試驗結果，我們在分離血清蛋白時選用的條件是：單體濃度6.25-6.5%，雙體佔總丙烯酰胺量的4-5%，正離子採用三羥甲基氨基甲烷，二甲氨基丙腈及過硫酸銨濃度分別為0.25%及0.7%。電泳電壓以7-10V/cm較為合適。但電泳時間較長，約2-3小時，室温低時可以電壓稍高。如果室温較高則可以在冰箱中進行電泳。

2、人血清及其酒精分劃部分的凝膠電泳

採用上述條件我們進行了正常人血清的凝膠電泳。一般可以分成15-20條區帶。根據兩向電泳方法比較了紙電泳和凝膠電泳各區帶的相對關係。紙電泳上的a：區帶在凝膠電泳中可被分離成10條以上區帶。但紙電泳中d，區帶的一部分則與凝膠電泳中自蛋白區帶相重合。在正常人血清中後白蛋白（PA）、轉鐵蛋白（Tr）和觸珠蛋白（HP）均有不同的型。較純晦白蛋白和丙種球蛋白部分，在凝膠電泳中可見明顯的其他蛋白區帶。

3、放射病狗血清蛋白電泳的觀察

放射病動物血清蛋白的改變可以在紙電泳中觀察到。一般認為狗在照射後吻球蛋白有增高。用凝膠電泳觀察可以得到更深入的資料。正常狗血清的凝膠電泳圖譜大致人相似。狗受致死量照射後第九天有明顯變化。我們用3-10型光 譜儀用光密度計將電泳圖譜進行了掃描。由於儀器的限制光縫最小隻能達到0.5mm，從而影響了其分辨力。但與正常血清對比可以見到其改變的情況，這遠比紙電泳中所見更為明顯。

4、在分離正常人尿DNase時的凝膠電泳

觀察用葡聚糖凝膠分離人尿中DNase時可以除去大部分其他蛋白質和雜質。但分離所得的製品用凝膠電泳觀察還可以見到五條以上的蛋白質區帶。將凝膠條在未染色前置於含大分子DNA的瓊脂平板上，在37℃温箱中保温2-3小時，再用5%三氯醋酸加至如此處理過的瓊脂板上，可以看到乳白色本底上出現被酶水解後的透明斑點。將凝膠條用氨黑染色後顯示其蛋白區帶的位置。二者比較就可以確定具有酶活性的成分的相應電泳位置。我們的試驗中觀察到人尿DNase在凝膠電泳中至少被分離成二條以上有酶活性的區帶。説明有同功酶的可能。應用這一方法可以較深人地觀察體液中酶的情況。同時也説明可以用凝膠電泳來指示生物製劑製備過程中純化的情況。