蛋白質磷酸化

蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。蛋白質磷酸化主要發生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸(包括蘇氨酸)，另一種是酪氨酸。這兩類酸磷酸化的酶不一樣，功能也不一樣，但也有少數雙功能的酶可以同時作用於這兩類氨基酸，如MEK(促絲裂原活化蛋白激酶激酶mitogen-activated proteinkinase kinase ,MAPKK)。絲氨酸磷酸化的主要作用是變構蛋白質以激活蛋白質的活力，主要是指酶活力。而酪氨酸磷酸化除了在變構以及激活該蛋白的活力之外，更重要的功能是結合蛋白提供一個結構基因，以促進其和其他蛋白質相互作用而形成多蛋白複合體。蛋白複合體的形成再進一步促進蛋白質的磷酸化。週而復始，由最初蛋白質磷酸化所產生的信號就一步步如此轉下去。如果最初產生的是一個刺激細胞生長的信號，此信號便最終轉入細胞核，導致DNA複製和細胞分裂。

因此，酪氨酸磷酸化和多蛋白複合體的形成構成了細胞信號轉導的基本機制，幾乎所有的多肽細胞生長因子都是通過此途徑來激活細胞，刺激細胞生長。因而催化蛋白質酪氨酸磷酸化的酶，酪氨酸激酶(tyrosine kinases)是成為信號轉導機制和控制細胞生長的關鍵分子。酪氨酸激酶和蛋白質酪氨酸磷酸化在腫瘤的發生和生長中也起了決定性的作用。許多抗腫瘤藥物的研製都着眼於此類分子。

蛋白質翻譯後修飾是蛋白質化學研究的重要領域，對蛋白質結構的細節瞭解得越多，對蛋白質翻譯後修飾的分類範圍瞭解得也就越廣。蛋白質修飾包括糖類、脂類、核酸、磷酸、硫酸、羧基、甲基、乙酰基、羥基等功能基團以共價鍵與蛋白質的連接。蛋白質經過修飾，在結合、催化、調節及物理性質等方面都被賦予了新的功能。蛋白質磷酸化是蛋白質翻譯後修飾的重要內容，在酶和其它重要功能分子活性的發揮、第二信使傳遞和酶的級聯作用中起到重要的作用。蛋白質磷酸化是在一系列蛋白激酶的作用下完成的，本節主要介紹蛋白磷酸激酶的分離與分析和磷酸化蛋白質的分析方法。

在信號傳導中的作用：（1）細胞內的信號蛋白主要分為兩大類：一類在蛋白激酶的作用下磷酸化，共價結合ATP所提供的磷酸基團；另一類則在信號作用下結合GTP，通常以GTP取代GDP。

（2）這兩種胞內信號蛋白的共同特徵是，在信號達到時通過獲得一個或幾個磷酸基團而被激活，而在信號減弱時能去除這些基團，從而失去活性。在信號中繼網中，某個信號蛋白磷酸化通常造成下游的蛋白依次發生磷酸化，形成磷酸化級聯反應。

（3）蛋白質的磷酸化主要集中在肽鏈中的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基上，這些殘基上具有遊離的羥基，且本身不帶電荷，當磷酸化作用後，蛋白質便具有了電荷，從而使結構發生變化，進一步引起蛋白質活性的變化，這也是蛋白質磷酸化的意義所在。

蛋白磷酸激酶的純化與活性分析

蛋白磷酸激酶是能催化磷酸基團從磷酸供體轉移到受體蛋白的酶，通常ATP的γ位磷酸(或其它三磷酸核苷)為供體。國際生物化學聯合會根據受體氨基酸的特異性，將蛋白激酶分為以下幾類：

①以蛋白乙醇基作為受體的磷酸轉移酶稱為蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶;

②以苯基為磷酸受體的磷酸轉移酶稱為蛋白酪氨酸激酶;

③以His，Arg或Lys為受體的磷酸轉移酶稱蛋白His激酶;

④以Cys殘基作為受體的磷酸轉移酶稱蛋白Cys激酶;

⑤以乙酰基作為受體的磷酸轉移酶稱天冬或谷氨醯胺激酶。

前兩類酶最常見，許多蛋白絲/蘇氨酸或酪氨酸激酶已被純化。利用分子生物學技術，已克隆出100多個蛋白激酶的基因。有些已通過測定其核苷酸序列而推出其相應的氨基酸序列。在很多情況下，克隆的酶基因產物氨基酸受體特異性不能被直接測定，一般是通過序列分析與已知特異性的蛋白激酶比較而得出。所有已知的絲/蘇和酪氨酸蛋白激酶都有一個共同的催化結構域(約270個氨基酸)，通過催化結構域的序列同源性比較，可將蛋白酪氨酸激酶家族分成若干亞家族。蛋白絲/蘇氨酸激酶家族較酪氨酸激酶家族大。此外，還有許多有關His，Lys和Arg特異性磷酸化酶活性的報道，但這些酶未被純化，其分子結構也不清楚。

(一)蛋白磷酸激酶的純化

蛋白激酶的純化分微量純化和大量純化兩種，前者通常應用在特殊條件下培養的細胞，後者一般應用於特殊的組織器官。微量純化的優點是克隆化的細胞株具有均一的細胞類型並處於同步的細胞週期，細胞內成分可被放射性同位素特異標記，在細胞培養時加特殊因素可研究細胞內某些感興趣的途徑。缺點是原料少，純化出的蛋白量有限。

對某種新的蛋白激酶的物理特性一般並不清楚，因此對未知蛋白激酶的純化沒有一個固定的程序。為了從有限的原材料中純化蛋白激酶，通常採用的策略是：

①在進行高效的親和純化以前採用傳統的色譜方法去除含量最多的雜蛋白;

②在純化早期去除抑制劑和失活劑;

③處理體積應儘快減小並避免透析;

④純化步驟儘量快並避免冷凍。

用於去除大量雜蛋白的傳統色譜技術包括陽離子和陰離子交換、疏水和凝膠排阻色譜。這些技術在許多有關蛋白質純化的書籍中都有詳細介紹，酶純化的理想方案應在各步驟間不經透析即能進行順利過渡。如離子交換步驟以後進行疏水色譜;凝膠排阻色譜放在最後使蛋白質和鹽分子分開，但要注意在凝膠排阻介質中加入0.2～0.5mol/L鹽以防酶非特異地與介質結合或聚合。檢查酶在離子交換和疏水柱上的結合和洗脱行為的最簡單方法是根據酶的理化特性將少量介質與少部分蛋白激酶在合適的pH下混合，然後變化離子強度後分析上清中酶的活性。完成以上純化步驟後，可以進行親和純化(常用的親和配基為三磷酸核苷、底物或效應物分子)。通過高效親和純化手段使蛋白磷酸激酶達到104～106倍數的純化，才能使產物達到均一。

為了自培養細胞或組織器官中純化蛋白激酶，通常選用惰性系統，如Pharmacia的FPLC系統。該系統的優點是具有很大的內在惰性，並具有保持大分子生物活性的特點。該系統在一個單元內含有單一的硬件，可在冷室和室温操作。此外，可採用快速的梯度(40～45分鐘)形式和較廣適用範圍的高效凝膠和柱系統。這是因為在此條件下多數蛋白質不與樹脂結合，包括能使激酶失活的磷酸酶。然而，許多激酶儘管其表現等電點≤5.5，但在中性條件下仍可與MonoS結合，這可能是由於其磺酸基與ATP或底物分子結構有些類似。大體積抽提物可用泵直接進樣，並進行連續兩次的離子交換分離。FPLC預裝的凝膠排阻柱可在30分鐘內完成分離，較傳統凝膠快得多。但由於柱填料粒度小，上樣體積不超過200μl，樣品量不超過5～10mg，純化量較小有些性質難以鑑定，因而需多次純化。Pharmacia引入一種新的介質(Sephacryl HR)較傳統的超細膠流速快5倍，這些凝膠在很大程度上減小了凝膠過濾色譜的時間。在完成親和純化後，酶的純度可用SDS-PAGE檢測並定量測定其比活性。

(二)蛋白磷酸激酶的活性分析

蛋白激酶活性分析分為兩步：

①末端標記的三磷酸核苷核供體(通常是ATP，有時用GTP)中的磷酸基團轉移到蛋白質或肽底物上;

②將磷酸化的底物分離出並進行定量分析。

前者通常在溶液中進行，酶和底物均在液相中。後者為了去除遊離的標記核苷酸，通常需要用三氯醋酸沉澱、SDS-PAGE分離或使標記底物結合於纖維素膜上。

有時可將酶或底物固定於固相載體上，如蛋白質混合物經SDS-PAGE後轉移到硝酸纖維素膜上，然後封閉，放入含有酶和標記ATP的溶液中。或者更進一步，設計一個蛋白激酶分析系統(酶活性的原位分析)，將蛋白激酶和它的底物均固定於硝酸纖維素膜上，這一方法可與標準的液相分析方法達到相等的靈敏度和線性範圍。其分析原理是含有蛋白激酶活性的樣品先固定於硝酸纖維素膜上(點滴或真空抽吸)，然後將濾膜浸入合適的蛋白底物溶液中，底物蛋白質與剩餘的膜結合位點結合，然後加入同位素標記的ATP，作用一定時間後洗去膜上未反應的ATP並終止反應，參入物經放射自顯影或液閃計數定量，與膜結合的酶和底物均具有一定的運動性，兩者反應的定量值代表磷酸化的程度。

以酪蛋白激酶Ⅱ的活性測定方法為例：

試劑：緩衝液A25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，100mmol/LNaCl，pH8.0

緩衝液B25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，200mmol/L NaCl，10%甘油

(V/V)，1mmol/L DTT，pH8.0

酪蛋白激酶Ⅱ底物　水解或部分脱磷酸的酪蛋白10mg/ml溶解於緩衝液A中。

酪蛋白激酶Ⅱ反應混合物　25mmol/L Tris，pH8.5，100mmol/L NaCl，10mmol/LMgCl2，1mmol/L DTT，0.1μmol/L〔V-32P〕ATP(100Ci/mmol)

操作步驟：

1.剪一適當大小的硝酸纖維素膜並劃成25px大小的方格;

2.用緩衝液A浸濕膜並放於一用同樣緩衝液浸濕的濾紙上，使膜平坦;

3.用緩衝液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度，膜上每個點所加的樣品其激酶活性在0.5～50pmol單位(1pmol單位代表每分鐘轉移1pmol 32P的酶量)，當酶比活性在1μmol/min·mg-1時則每個點應加純酶0.5～50ng;

4.用微量加樣器加1～5μl樣品於膜上方格中央，待液滴消失後將膜面對含有緩衝液A(包括1～10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(貼於玻璃平板上)，在濕潤環境中23℃作用30分鐘。大片膜可密封於塑料袋中;

5.在100ml緩衝液A中洗膜並置於一新的Parafilm膜上(加有反應混合物溶液25μl/cm2)，23℃作用5～30分鐘;

6.用緩衝液A 100ml洗膜4次，空氣乾燥後進行放射自顯影。或切成方塊進行液閃計數定量。

該方法在應用時最常見的問題是硝酸纖維素膜過載(指總蛋白或酶活力單位)。硝酸纖維素膜結合BSA的線性範圍可達50μg/cm2(相當於每斑點5μg)，而結合容量可達500μg/cm2，如果樣品本身造成蛋白質超載，則應降低稀釋液中的BSA濃度。同時應注意不要加過量的酶，因為超過50pM單位即超過了該方法的線性範圍，並可能影響硝酸纖維素膜鄰近斑點的檢測。該方法用於其它蛋白激酶檢測時應適當變換測定條件。因蛋白激酶活性的斑點印跡方法與標準的液相方法在靈敏度、檢測範圍、線性等方面相當，所以可以代替後者進行常規檢測。也在天然凝膠電泳和轉移電泳後分析蛋白激酶活性的分佈，可用於分析酶在不同發育階段各組織表達的變化、cDNA克隆分析和突變體分析。