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生物活性

鎖定
生物活性,在材料領域裏主要指能在材料與生物組織界面上誘發特殊生物、化學反應的特性,這種反應導致材料和生物組織間形成化學鍵合。在生物礦化過程中,主要指生物材料與活體骨產生化學鍵合的能力,是衡量生物材料的一個重要指標,可通過材料表面在人體模擬體液(simulated body fluid-SBF)中形成磷灰石的能力能夠反應材料在體內的生物活性,此評價材料生物活性方法的應用可以減少實驗所需動物數量,同時增加動物實驗的可持續時間 .
中文名
生物活性
含    義
材料與生物組織界面上誘發
反    映
化學鍵合
標    準
體液中形成磷灰石

生物活性理論背景

該概念是在 1969 年美國人 L.Hench 在研究生物玻璃時發現並提出,進而在生物陶瓷領域引入了生物活性概念,開創了新的研究領域。經過 30 多年來的發展,生物活性的概念在生物材料領域已建立了牢固的基礎,如β-磷酸三鈣可吸收生物陶瓷等,在體內可被降解吸收併為新生組織代替,具有誘出特殊生物反應的作用;羥基磷灰石由於是自然骨的主要無機成分,故植入體內不僅能傳導成骨,而且能與新骨形成骨鍵合,在肌肉、韌帶或皮下種植時,能與組織密合,無炎症或刺激反應。生物活材料具有的這些特殊的生物學性質,有利於人體組織的修復,是生物材料研究和發展的一個重要方向。

生物活性常見材料

磷酸鈣材料
磷酸鈣生物活性材料主要包括磷酸鈣骨水泥和磷酸鈣陶瓷纖維兩類。前者是一種廣泛用於骨修補和固定關節的新型材料,國內研究抗壓強度已達60MPa以上。後者具有一定的機械強度和生物活性,可用於無機骨水泥的補強及製備有機與無機複合型植人材料。磷酸鈣纖維或晶須具有良好的生物活性和生物相容性,對人體無毒副作用,是生物陶瓷材料和有機高分子材料的理想增強材料。
羥基磷灰石
羥基磷灰石是目前研究最多的生物活性材料之一,作為最有代表性的生物活性陶瓷-羥基磷灰石[Ca10(P04)6(OH)2,簡稱HA] 。羥基磷灰石與脊椎動物骨和齒的主要無機成分相同,結構也非常相近,與動物體組織的相容性好,無毒副作用,界面活性優於各類醫用鈦合金、硅橡膠及植骨用碳素材料。可廣泛應用於生物硬組織的修復和替換材料,如口腔種植、牙槽脊增高、耳小骨替換、脊椎骨替換等多個方面。另外,在HA生物陶瓷中耳通氣引流管、頜面骨、鼻樑、假眼球以及填充用HA顆粒和抑制癌細胞用HA微晶粉方面也有廣泛的應用。 羥基磷灰石受到本身脆性高、抗折強度低的限制,因此在承重材料應用方面受到了限制。目前製備多孔陶瓷和複合材料是該材料的重要發展方向,製備塗層材料也是其重要分支之一。
生物活性玻璃
生物活性玻璃是一類能對機體組織進行修復、替代與再生、具有能使組織和材料之間形成鍵合作用的材料。生物活性玻璃(bioactiveglass,BAG)在1969年由Hench發現,由SiO2,Na2O,CaO和P2O5等基本成分組成的硅酸鹽玻璃。生物活性玻璃的降解產物能夠促進生長因子的生成、促進細胞的繁衍、增強成骨細胞的基因表達和骨組織的生長。是迄今為止唯一既能夠與骨組織成鍵結合,同時又能與軟組織相連接的人工生物材料。

生物活性活性檢測

生物活性成骨活性

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能夠反應材料在體內的生物活性,具體檢測方法如下:
1.SBF 配置
由於SBF 溶液對於磷灰石過飽和,所以配備方法不恰當會導致溶液中磷灰石沉澱產生。整個配備過程需要確保溶液無色、透明,容器表面無沉澱出現,如果過程中產生沉澱,倒去溶液,洗淨儀器重新配製。準備一個 1000ml 的塑料燒杯。首先於塑料燒杯中裝好 700ml 離子交換蒸餾水、一個適當大小磁子,杯口密封以蒸發皿或塑料薄膜。攪拌並調節水温至 36.5±1.5C。
按表1所列順序在 36.5C 恆温下逐個溶解第一到第八個化合物,溶解過程
表1 配置1000 ml SBF 溶液時試劑添加順序、添加量
Order
Reagents
Amounts
Containers
Purities(%)
Formula weights
1
NaCl
8.035
Weight paper
99.5
58.4430
2
NaHCO3
0.355
Weight paper
99.5
84.0068
3
KCl
0.225
Weight bottle
99.5
74.5515
4
K2HPO4·3H2O
0.231
Weight bottle
99.0
228.2220
5
MgCl2·6H2O
0.311
Weight bottle
98.0
203.3034
6
1.0 M-HCl
39ml
Graduated cylinder
7
CaCl2
0.292
Weight bottle
95.0
110.9848
8
Na2SO4
0.072
Weight bottle
99.0
142.0428
9
Tris
6.118
Weight paper
99.0
121.1356
10
1.0 M-HCl
0-5ml
Syringe
2.磷灰石形成能力測試
對於密質薄片材料,測出樣品尺寸並計算樣品表面積精確到 2mm 應用如下公式計算出 SBF 用量:
Vs=Sa/10,
Vs(ml)是 SBF 的體積量,Sa(mm)表示樣品的表面積。
對於多孔材料,SBF 的用量應大於上式計算量準備好塑料瓶或燒杯,裝入計算出的 SBF 體積量加熱到 36.5C, 然後按示意圖往裏放置樣品。 筆記:樣品在容器中放置有兩種情況,如圖 1(a),1(b)。少數情況下,SBF 溶液會生成同 質磷灰石沉積於樣品表面。所以如果樣品放置是圖 A1(b)種情況,表徵實驗應該檢測樣品的 下表面。 四個星期內,分別取出恆温浸透不同時長的各組樣品,純水輕盈洗淨。然後將樣品放入乾燥 器中常温乾燥。
圖1 SBF中樣品浸泡示意圖

生物活性細胞活性

1.四唑鹽(MTT)比色法:
檢測細胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外,還可用四唑鹽比色法試驗(MTT)。此法的原理是:活細胞線粒體中的琥珀酸脱氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物,並沉積在細胞中,而細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結晶物,用酶聯免疫檢測,以在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反應活細胞數量。在一定細胞數範圍內,MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞,用含0.1%胎牛血清的RPMI培養基配成1x10^9個/L的但細胞懸液,將細胞接種於96孔培養板中,每孔100ul。
●將培養板置CO2培養箱中,在37℃、5%CO2條件下,培養3-5天。
●培養3-5天后,每孔加入MTT溶液10ul,繼續置培養箱孵育3-6h,終止培養,加10%SDS-HCl 100ul/孔,37℃培養數小時,將細胞內與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。
●用酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度(OD),選波長490nm。以時間為橫軸,OD值為縱軸繪製細胞生長曲線。
用此法測細胞活力,為保證結果的準確性,最好在試驗前測定每種細胞的貼比率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,再確定每孔細胞接種數和培養時間,以保證培養終止時不會過滿。另外,實驗時設空白對照,比色時,以空白孔調零。
3.2.2 CCK-8 法
Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑可用於簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脱氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
● 製備細胞懸液:細胞計數
● 接種到96孔板中:根據合適的鋪板細胞數,每孔約100ul細胞懸液,同樣的樣本可做3個重複。
● 37℃培養箱中培養:細胞接種後貼壁大約需要培養2-4小時,如果不需要貼壁,這步可以省去。
●加入10ul CCK8:由於每孔加入CCK8量比較少,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基,以換液的形式加入。
●培養1-4小時:細胞種類不同,形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,可以繼續培養,以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少,需要較長的顯色時間(5-6小時)。
●測定450nm吸光度:建議採用雙波長進行測定,檢測波長450-490nm,參比波長600-650nm。