藍白斑篩選

藍白斑篩選(5張)

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據載體的遺傳特徵篩選重組子，主要為α-互補 ^[1]  與抗生素基因。藍白斑篩選在指示培養基上，未轉化質粒的菌落因無抗生素抗性而不能生長，重組質粒的菌落是白色的，非重組質粒的菌落是藍色的，以顏色不同為依據直接篩選重組克隆的方法 ^[2]  。

一些載體（如PUC系列質粒）帶有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的編碼區，該編碼區中含有多克隆位點（MCS），可用於構建重組子 ^[3]  。這種載體適用於僅編碼β-半乳糖苷酶C端ω片段的突變宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有半乳糖苷酶活性，但它們同時存在時，α片段與ω片段可通過α-互補形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落。而當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後，幾乎不可避免地破壞α片段的編碼，使得帶有重組質粒的LacZ-細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，稱為藍白斑篩選。

設計適用於藍白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N端一個146個氨基酸的短肽（即α肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用於X-gal產生藍色物質。用於藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的啓動子；編碼α肽鏈的區段；一個多克隆位點（MCS）。MCS位於編碼α肽鏈的區段中，是外源DNA的選擇性插入位點。雖然上述缺陷株基因組無法單獨編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當菌體中含有帶lacz'的質粒後，質粒lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍色物質的能力，這種現象即α-互補。

操作中，添加IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啓動子，在含有X-gal的固體平板培養基中菌落呈現藍色。以上是攜帶空載體的菌株產生的表型。當外源DNA（即目的片段）與含lacz'的載體連接時，會插入進MCS（位於LacZ'中的多克隆位點），使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質粒不再表達α肽鏈，將它導入宿主缺陷菌株則無α互補作用，不產生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養基中的X-gal產生藍色，培養表型即呈現白色菌落。

實驗中，通常藍白篩選是與抗性篩選一同使用的。含X-gal的平板培養基中同時含有一種或多種載體所攜帶抗性相對應的抗生素，這樣，一次篩選可以判斷出：未轉化的菌不具有抗性，不生長；轉化了空載體，即未重組質粒的菌，長成藍色菌落；轉化了重組質粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。

①載體處理的好，實驗很成功，全是陽性克隆。

②使用的培養基含有乳糖或葡萄糖，因為半乳糖苷酶會分解乳糖，導致不能與X-gal反應，而葡萄糖不會誘導融合基因的表達。

③操作時，Amp、IPTG和X-gal其中一種或幾種沒塗均勻。

二、沒有白斑

①外源目的基因沒連接上，可能有外源目的基因的問題，如片段過大，或者是載體的問題。

②實驗操作過程中抑菌做得不好，都是雜菌。

③忘記加入誘變劑IPTG或生色底物X-gal，或這兩種試劑變質。

④插入的外源目的基因片段較短，且插入後的基因讀碼框恰好和lacZ基因相吻合。

三、無菌落生長

①IPTG使用濃度太高，IPTG對菌體是有毒性的。

②Amp使用濃度過高。

③感受態細胞全部死亡。 ^[4]