載體

基因工程的一個重要環節是基因工程載體( vector)的設計和應用。基因克隆過程中往往需要藉助特殊的工具才能使外源DNA分子進入宿主細胞中並進行復制和表達。這種攜帶外源目的基因或DNA片段進入宿主細胞進行復制和表達的工具稱為載體。

一般來説，理想的基因工程載體須具備以下功能：

①具有複製起始位點，能使插入的外源目的基因或DNA片段在宿主細胞內進行獨立並且穩定的自我複製；

②在DNA複製的非必需區具有多種限制酶的單一識別位點，能被各種限制酶所識別並插入外源DNA片段；

③具有用來篩選重組體DNA的選擇標記基因；

④序列較短，利於容納較長的外源DNA片段；

⑤具有較高的遺傳穩定性。為了滿足以上要求，通常選擇生物體天然存在的質粒和噬菌體或病毒DNA作為載體母本，對其進行必要的修飾和改造，構建出具有多種作用的載體DNA分子。

載體按功能可分為克隆載體和表達載體。克隆載體是最簡單的載體，主要用來克隆和擴增DNA片段。主要有質粒載體、噬菌體載體、噬菌粒載體、病毒載體。表達載體除具有克隆載體的基本元件外，還具有轉錄、翻譯所必需的DNA元件，如啓動子和終止子。為了實現外源基因在不同表達載體中進行復制和表達，基因工程操作中常使用穿梭載體( shuttle vector)。穿梭載體含有兩個親緣關係不同的複製子，能在兩種不同的細胞中複製，如既能在原核生物中複製也能在真核生物中複製的載體，不僅具有細菌質粒的複製原點及選擇標記基因，還有真核生物的自主複製序列( ARS)以及選擇標記性狀，具有多克隆位點 ^[1]  。

①在宿主細胞中能保存下來並能大量複製，且對受體細胞無害，不影響受體細胞正常的生命活動。

②有多個限制酶（Restriction enzymes）切點，而且每種酶的切點最好只有一個，如大腸桿菌pBR322就有多種限制酶的單一識別位點，可適於多種限制酶切割的DNA插入。

③含有複製起始位點，能夠獨立複製；通過複製進行基因擴增，否則可能會使重組DNA丟失。

④有一定的標記基因，便於進行篩選。如大腸桿菌的pBR322質粒攜帶氨苄青黴素抗性基因和四環素抗性基因，就可以作為篩選的標記基因。一般來説，天然運載體往往不能滿足上述要求，因此需要根據不同的目的和需要，對運載體進行人工改建。當前所使用的質粒載體幾乎都是經過改建的。

⑤載體DNA分子大小應合適，以便操作。

基因克隆的載體類型：質粒載體，噬菌體載體，柯斯質粒載體，M13噬菌體載體，噬菌粒載體。

質粒載體是一種相對分子質量較小、獨立於染色體DNA之外的環狀DNA(一般有1～200 kb左右，kb為千鹼基對)，有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。質粒能通過細菌間的接合由一個細菌向另一個細菌轉移，可以獨立複製，也可整合到細菌染色體DNA中，隨着染色體DNA的複製而複製。

利用噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，並隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。

質粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由於動物細胞的培養和操作較複雜、花費也較多，因而病毒載體構建時一般都把細菌質粒複製起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然後再引入真核細胞。

當前人們還在不斷尋找新的運載體，如葉綠體或線粒體DNA也有可能成為運載體。

絕大多數分子克隆實驗所使用的載體是DNA雙鏈分子，其功能包括以下幾方面。

(1)為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力。從理論上講，任何DNA分子均可以物理滲透的方式進入生物細胞中，但這種頻率極低，以至於在常規的實驗中難以檢測到。某些種類的載體DNA分子本身具有高效轉入受體細胞的特殊生物學效應，因此由外源基因與載體拼接所形成的DNA重組分子轉入受體細胞的概率比外源DNA片段單獨轉化要高几個數量級。

(2)為外源基因提供在受體細胞中的複製能力或整合能力。外源基因進入受體細胞後面臨兩種選擇，或者直接整合在受體細胞染色體DNA的某個區域內，作為其一部分複製並遺傳，或者獨立於受體細胞染色體DNA而存在，在後一種情況下，載體DNA分子必須為外源基因提供獨立的複製功能，否則外源基因不可能在受體細胞中複製和遺傳。

(3)為外源基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力。外源基因的擴增依賴於載體分子在受體細胞中高拷貝自主複製的能力，這種能力通常由載體DNA上的若干相關基因編碼。同時，外源基因高效表達所需的調控元件一般也由載體分子提供。

應當指出的是，上述三大功能並非所有的載體分子都必須具備，DNA重組克隆的目的不同，對載體分子的性能要求也不同。但對於所有不同用途的載體而言，為外源基因提供複製或整合能力是必不可少的，因此通常選擇生物體內天然存在的質粒以及噬菌體或病毒DNA作為載體藍本，並根據分子克隆的操作原理，對之進行必要的修飾和改造，構建出具有多種性能的載體DNA分子 ^[2]  。

一個理想的載體至少應具備下列五個條件：

(1)具有對受體細胞的可轉移性或親和性，以提高載體導入受體細胞的效率；

(2)具有與特定受體細胞相適應的複製位點或整合位點，使得外源基因在受體細胞中穩定遺傳；

(3)具有較高的外源DNA的載裝能力，以滿足長片段的克隆；

(4)具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點，有利於外源基因的拼接插入；

(5)具有合適的選擇性標記，便於重組DNA分子的檢測。

載體的可轉移性和可複製性取決於它與受體細胞之間嚴格的親緣關係，不同的受體細胞只能使用相匹配的載體系統 ^[2]  。