黏性質粒載體

由於真核基因的結構與功能研究的需要，人們發展出比λ噬菌體載體具有更大克隆能力的新型的載體——柯斯質粒載體(cosmid vectors，cosmid是COS site—carrying plasmid的縮寫)，也稱為黏陛質粒或黏粒。這是一類人工構建的含有抗性基因、單一克隆位點以及λDNACOS位點(體外包裝所必需)的細菌質粒。黏粒DNA和外源DNA經酶切後，需在較高濃度下連接，使兩個cos位點之間有一個完整的質粒序列。當體外包裝時，帶有外源DNA的重組黏粒在cos位點上被切開，包裝成為成熟的噬菌體顆粒。這樣，噬菌體顆粒在感染菌體內重組DNA通過噬菌體的黏端而環化，並可以在宿主內自我複製，表達抗性標記。例如採用黏粒C2RB進行克隆時，首先在插入位點和兩個C08基因之間切開載體，插入外源DNA，由於在兩cos基因之間有一個完整的質粒序列，在體外包裝成為病毒顆粒後可感染大腸桿菌，根據其抗藥標誌選擇轉化子菌落。

常用的黏粒主要有pHC79、pJB8、MUA一3、pKU206和KOSI等，它們大多具有一種或多種限制性內切酶的單一酶切位點。pUC118與pUC119是一對相同序列的載體，但是多克隆位點區的方向相反，使外源DNA可以以正、反方向插入，它們由M13與pBR322的有關片段構建而成。

(1)由質粒與λDNA組成的一種4～6kb的環狀雜種DNA，容易分離並可離體操作。攜帶抗生素抗性基因為選擇標記，帶有pUC質粒的細菌能在含抗生素的培養基上生長。它既能像質粒一樣在細菌中繁殖(pJB8、c2RB等)，有的可以在哺乳動物細胞內繁殖(pWEl5/16等)，又能像λDNA一樣體外包裝，並高效導入受體細胞。

(2)克隆容量較大(可克隆35～45kb的基因組DNA)。採用這種大容量載體不僅可以減少構建基因組DNA文庫的重組克隆數目，減少工作量，提高篩選時的陽性檢出率，而且可以在單個重組體中克隆和增殖完整的真核基因。

(3)屬鬆弛型質粒，拷貝數很多，小體積的細菌培養可收穫高產量的所需DNA ^[1]  。

基因表達載體的構建(即目的基因與運載體結合)是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。所謂載體，即連接目的基因、能獨立於細胞染色體之外複製的DNA片段。目前，人們在基因工程中通常選用的載體有細菌質粒載體、λ噬菌體載體、柯斯質粒載體和病毒載體等。

一個理想的基因載體應該具有以下幾個基本條件：①能在宿主細胞進行獨立和穩定的DNA自我複製，並在其DNA中插入外源基因後，仍然保持着穩定的複製狀態和遺傳特性；②易於從宿主細胞中分離，並進行純化；③在其DNA序列中，具有適當的限制性內切酶位點(最好是單一酶切位點)。這些位點位於DNA複製的非必需區內，可以在這些位點上插入外源DNA，但不影響載體自身DNA的複製；④具有能夠觀察的表型特徵，在插入外源DNA後，這些特徵可以作為重組DNA的選擇標誌。

上述基本條件主要是從原核生物DNA重組中得出的。到了真核生物階段，由於將外源DNA引入宿主的方法有了改進，突破了原有要求重組DNA片段的大小限制．因此使得外源DNA進入宿主的能力增強了；同時．由於篩選重組體技術的改進，原來要求載體或外源DNA上有選擇標記已經被雜交技術、免疫學技術等替換，從而擴大了DNA重組技術使用的範圍。所以，作為載體的最基本要求有了改變，即要有自主複製能力和可利用的限制酶切點。

(1)質粒載體

質粒是小型環狀DNA分子，大小為1～200kb(1kb=1000鹼基對)。質粒不同於病毒，是裸露的DNA分子，沒有外殼蛋白，在基因組中，也沒有溶菌酶基因。質粒在宿主細胞內才能完成自身複製，同時將編碼的一些非染色體控制的遺傳性狀進行表達，賦予宿主細胞一些額外的特性，包括抗性特性、代謝特性等，其中對抗生素的抗性是質粒最重要的編碼特性之一。

質粒載體絕大多數是以天然質粒為基礎，加以人工改造和組建。理想的細菌質粒載體，除去其他類型載體相同的特點外，還應具備以下條件：①相對分子質量儘可能小，質粒越小，拷貝數越高，而且便於提取和純化；②DNA結構和功能清楚，質粒序列中具有包含一系列單一限制酶酶切位點的多克隆位點，便於帶有不同末端的外源片段的插入；③具有在宿主中合適的一個或多個選擇標記，用以篩選攜帶有目的片段的克隆，這類選擇標記可以分為顯性標記和營養缺陷型標記，最主要的顯性標記是各種抗生素抗性基因(如氨苄青黴素抗性基因、四環素抗性基因、阿泊拉黴素抗性基因、氯黴素抗性基因等)；④缺失流動基因，這樣質粒就不會從一個細菌接觸轉移到另一個細菌。

在基因工程中，有些載體可用於外源基因的表達等特殊用途，但一般的克隆實驗可按載體的不同性質，區分為數種不同的類型。若DNA重組中克隆是要獲得大量的高純度的DNA片段，則可選用具有高拷貝數的質粒載體，如ColE1等鬆弛型複製子質粒；有些外源基因用高拷貝數質粒載體克隆後。其產物含量過高，會干擾寄主細胞的新陳代謝活動，對於這樣的克隆基因，則最好選用由嚴緊型複製子PSC101派生而來的質粒載體，如PLG338、PLG339等，這些質粒的拷貝數在每個細胞只有幾個，可在低水平的基因劑量下增殖克隆的外源DNA片段。

質粒克隆載體的設計和構建過程應遵循以下幾條原則。

①選擇合適的出發質粒

出發質粒也叫親本質粒，它應含有質粒克隆載體必備的元件，如複製起始位點、選擇標記基因、克隆位點、啓動子和終止子等。

②正確獲得構建質粒克隆載體的元件

一般採用限制性核酸內切酶切割出質粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段，還可以採用PCR技術從靶DNA中擴增出含某種元件的特異性DNA片段。

③組裝合適的選擇標記基因

構建的質粒克隆載體應該組裝什麼樣的選擇標記基因，必須根據要轉化的受體細胞的特性來決定。

④選擇合適的啓動子

為了構建表達質粒的克隆載體，必須組裝合適的啓動子，當設計真核生物的基因須在原核生物中表達式，常改用原核生物或病毒(噬菌體)基因的啓動子，而原核生物基因在真核細胞中表達時，仍可用原核生物基因的啓動子。

由於質粒載體可用於簡便、快速、大量地製備某些克隆的DNA片段，多年來被廣泛採用並改進，產生了更多更有用的質粒載體，如PBR322、PUC系列、PSP系列、BluescriptM等。這些載體多已商品化。可以直接購買。

(2)病毒和噬菌體載體

病毒主要有DNA(或RNA)和外殼蛋白組成，經包裝後成為病毒顆粒。通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的合成系統進行DNA(或RNA)複製和殼蛋白的合成，實現病毒顆粒的增殖。把感染細菌的病毒專門稱為噬菌體，由此構建的克隆載體則稱為噬菌體克隆載體。

噬菌體作為載體，可插入長10～20kb甚至更大的一些外源DNA片段，又由於噬菌體有較高的增殖能力，有利於目的基因的擴增，從而成為當前基因工程研究的重要載體之一。

野生型的噬菌體必須經過改造，才能成為比較理想的基因工程載體。噬菌體中首先被改造成為載體的是λ噬菌體，此外還有單鏈噬菌體載體、黏性質粒載體等。λ噬菌體由頭和尾構成，其基因組是長約49kb的線性雙鏈DNA分子，組裝在頭部蛋白質外殼內部，其序列已被全部測出。λ噬菌體感染時，通過尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質外殼留在菌外。DNA進入大腸桿菌後以其兩端12bp的互補單鏈黏末端環化成環狀雙鏈，可以兩種不同的方式繁殖：溶菌性方式(lytic pathway)和溶源性方式(lysogenic pathway)。λ噬菌體含有線性雙鏈DNA分子，其長度為48502bp。兩段各有由12個核苷酸組成的5’端凸出的互補黏性末端，當λDNA進入宿主細胞後，互補黏性末端連接成環狀DNA分子，連接處稱為cos位點。

構建λ噬菌體載體的基本途徑如下：①抹去某種限制性內切酶在λDNA分子上的一些識別序列，只在非必需區保留1～2個識別序列；②用合適的限制性內切酶切去部分非必需區，但是由此構建的λDNA載體不應小於38kb；③在λDNA分子的合適區域插入可供選擇的標記基因。值得指出的是，沒有適用於克隆所有DNA片段的萬能λ噬菌體載體，必須根據據需要選擇合適的噬菌體載體 ^[2]  。

(3)人工染色體克隆載體

人工染色體克隆載體實際上是一種穿梭克隆載體，含有質粒克隆載體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質粒複製起始位點，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA着絲點、端粒和複製起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因。這樣的克隆載體在第一受體細胞內可以按質粒複製形式進行高拷貝複製，在體外與目的DNA片段重組後，轉化第二受體細胞。

可在轉化的細胞內按染色體DNA複製的形式進行復制和傳遞，篩選第一受體的克隆子，一般採用抗菌素抗性選擇標記；而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補的營養缺陷型。與其他克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點是能容納長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

常見的人工染色體克隆載體主要有酵母人工染色體、細菌人工染色體載體和P1人工染色體載體等。

酵母人工染色載體(YAC)是利用釀酒酵母的染色體的複製元件構建的載體，其工作環境也是在釀酒酵母中。釀酒酵母的形態為扁圓形和卵形，生長的代時為90min。YAC載體的複製元件是其核心組成成分，其在酵母中複製的必需元件包括複製起點序列即自主複製序列、用於有絲分裂和減數分裂功能的着絲粒和兩個端粒(TEL)。YAC載體的選擇標記主要採用營養缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trpl、leu2澀和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3以及赭石突變抑制基因sup4等。與YAC載體配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變ade2一1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變抑制基因sup4的載體存在於細胞中時，可抑制ade2一1基因的突變效應，形成正常的白色菌落 ^[3]  。

利用這一菌落顏色轉變的現象，可用於篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。

細菌人工染色體載體(BAC)是基於大腸桿菌的F質粒構建的，高通量低拷貝的質粒載體。每個環狀DNA分子中攜帶一個抗生素抗性標記，一個來源於大腸桿菌F因子(致育因子)的嚴謹型控制的複製子oriS，一個易於DNA複製的由ATP驅動的解旋酶。BAC載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產生，減小外源基因的表達產物對宿主細胞的毒副作用。新型的BAC載體可以通過α互補的原理篩選含有插入片段的重組子，並設計了用於回收克隆DNA的Not工酶切位點和用於克隆DNA測序的Sp6啓動子、T₇啓動子。Not Ⅰ識別序列，位點十分稀少。重組子通過Not Ⅰ消化後，可以得到完整的插入片段。Sp6、T₇是來源於噬菌體的啓動子，用於插入片段末端測序 ^[4]  。

P1人工染色體載體(PAC)結合了P1載體和BAC載體的最佳特性，包括陽性選擇標記sacB及噬菌體P1的質粒複製子和裂解性複製子。然而除了將連接產物包裝進λ噬菌體顆粒以及在cre—loxP位點使用位點特異性重組產生質粒分子以外，在載體連接過程中產生的環狀重組PAC也可能用電穿孔的方法導入大腸桿菌中，並且以單拷貝質粒狀態維持。基於PAC的人類基因組文庫插入片段的大小在60～150kb之間。