噬菌体

[shì jūn tǐ]
能引起宿主菌裂解的一类病毒
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噬菌体(Bacteriophage,简称phage)是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称,因部分能引起宿主菌的裂解,故称为噬菌体。 [1] [7]该病毒由弗德里克· 特沃特和费利克斯· 德赫雷尔于20世纪初在葡萄球菌志贺菌中研究发现。噬菌体必须在活菌内寄生,有严格的宿主特异性,其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性。此外,噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体,通常在一些充满细菌群落的地方,如:泥土和动物的肠道。 [2] [7]
不同的菌体在电镜下有三种形态:蝌蚪形、微球形及丝杆形。大多数菌体呈蝌蚪形,由头部和尾部两部分组成。 [5]噬菌体的化学成分是由蛋白质包裹的外壳和内部的核酸两部分构成。 [5]根据感染细菌导致的不同结果可将噬菌体分为毒性噬菌体(virulent phage)和温和噬菌体(temperate phage)。 [5]此外还可以根据蛋白质结构分为无尾部结构的二十面体、有尾部结构的二十面体线状体。 [7]按核酸特点分为ssRNA(单链RNA)、dsRNA(双链RNA)、ssDNA(单链DNA)、dsDNA(双链DNA)。 [13]
噬菌体感染细菌的方式分为两种,一种是噬菌体在宿主细胞内进行增殖;另一种噬菌体不进行增殖,而是以潜伏状态存在于宿主细胞内。 [8]而细菌也可以通过选择进化出噬菌体无法识别的突变受体以及有效地限制酶活性方式来抵抗噬菌体的侵入。 [11-12]噬菌体可以应用于细菌鉴定和分型、诊断和治疗、检测标本中的待测菌、基因工程载体等。 [9-10]
中文名
噬菌体
外文名
Bacteriophage,phage
所属学科
微生物学
别    名
感染细菌的病毒
发现者
弗德里克· 特沃特、费利克斯· 德赫雷尔
形    态
蝌蚪形、微球形及丝杆形
组成成分
蛋白质、核酸
分    类
毒性噬菌体和温和噬菌体
感染方式
潜伏或侵染于宿主细胞内进行增殖
危    害
危害食品发酵、抗生素制造、微生物农药和有机溶剂发酵等生产过程
应    用
细菌鉴定和分型、诊断和治疗、检测标本中的待测菌、基因工程载体等
溶菌过程
吸附、侵入、增殖、成熟以及释放

发现历史

播报
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初期

1896年,英国细菌学家厄内斯特·汉金首次报道了噬菌体存在的可能性,其在研究中发现印度恒微朵汽河与亚穆纳河的污水表现治疗霍乱的作用,霍乱是由霍乱弧民榆菌引起。 [3]
费利克斯· 德赫雷尔(Felix d’Herelle)
1899年,伽马利亚氏在培养炭疽杆菌时首先发现雅匙说细菌有被溶噬现象。1915年,英国微生物学家弗德里克· 特沃特在伦敦布朗研究所进行天花疫苗研究时首次观察到噬菌体现象,同年,法国巴斯德研究所的费利克斯· 德赫雷尔在研究志贺氏菌痢疾时独立发现了类似现象,他将其命名为"bacteriophage"(噬菌体),并建立了病毒学研究的关键方法学体系。德赫雷尔系统论证了噬菌体的三大特性:① 特异性吸附宿主细胞;② 具有可定量测定的颗粒性特征(通过噬斑计数法);③ 能引起宿主细胞裂解(lysis)。两位科学家的平行发现共同开启了病毒学研究的新纪元。 [1-2]1917年,德赫雷尔的研究结果在法国科学学会上宣读并发表,他本人也被认为是噬菌体的发现者。 [3]
噬菌体发现后不久,其临床应用研究便迅速展开。1919年,德赫雷尔率先开展噬菌体治疗研究,使用噬菌体制剂成功治愈一名12岁细菌性痢疾男孩。1921年,理查德·布鲁诺格和约瑟夫·梅森首次报道噬菌体治疗葡萄球菌引皮肤感染的成功案例。 [3]同样是在1921年,布鲁塞尔巴斯德研究所的朱勒斯·博尔德特(Jules Bordet)提出了一个具有争议性的观点:他认为德赫雷尔所描述的"噬菌体"并非独立病原体,而可能只是细菌自身产生的某种促进繁殖的酶。 [4]
1934年,马克斯·史莱辛格通过研究纯化的噬菌体取得了重大发现:他测定噬菌体的最大线性尺寸为0.1微米,质量约为4×10⁻¹⁷克,并首次确定其化学组成为等比例的蛋白质和DNA。 [4]1940年苏联科学家又得到了气性坏疽恋仔及破伤风杆菌等的噬菌体。 [2]

现代

马克斯·德尔布吕克(Max Delbrück)
柜谜1937年,,德国物理学家马克斯·德尔布吕克(Max Delbrück)与研究员埃默里·埃利斯展开合作,将T-偶数噬菌体(T2、T4、T6)确立为研究病毒复制的模式生物。德尔布吕克和埃利斯共同开发的一步生长曲线实验(one-step growth experiment),该实验首次精确定义了病毒复制的潜伏期(约30分钟),揭示了病毒感染后经历隐蔽期(失去传染性)继而爆发性增殖的特性。 [4]
1940年,德尔布吕克与意大利流亡科学家萨尔瓦多·卢里亚在哥伦比亚大学组建了被后人称为"噬菌体研究小组"(Phage Gro雄精炒盼up)的团队,两人利用细菌病毒作为了解生命进程的一个模型,并与1941年应邀前往冷泉港实验室做实验。 [4]
20世纪40年代后期至50年代初期,电子显微学家汤姆·安德森与德尔布吕克合作,首次获得噬菌体的清晰电子显微照片,这一技术突破为病毒结构研究提供了直接证据。与此同时,首批噬菌体变异株被成功分离和鉴定,标志着遗传学研究进入新阶段。冷泉港实验室开设的首个噬菌体课程和举行的首次噬菌体会议,标志着这一研究领域的制度化进程。随后的二十五年数百名科学家围绕T-偶数噬菌体在大肠杆菌中的溶菌性感染、λ噬菌体的溶原性现象以及特殊噬菌体的复制机制等方向展开深入研究。 [4]
在研究方法上,西摩·科恩运用比色分析法,首次揭示了噬菌体感染对宿主细胞大分子合成的深刻影响。同时,与蒙诺德和沃尔曼的研究共同证明,病毒感染可将潜伏期划分为不同阶段。 [4]1949年,巴斯德研究所的安德烈·勒沃夫通过显微操作实验证明,溶源性细菌中的原噬菌体以非感染性状态稳定遗传,首次揭示了病毒基因组的潜伏状态。 [4]
显微镜下噬菌体
1953年,怀亚特和科恩在研究T-偶数噬菌体时发现了5-羟甲基胞嘧啶这一特殊碱基,它完全取代了宿主DNA中的胞嘧啶,后续研究证实这一修饰碱阀懂耻基由病毒基因编码。这一时期的研究在多个层面取得进展:在遗传学方面,通过对T-偶数噬菌体rⅡ和B顺反子的精细分析,建立了遗传图谱绘制方法,并深入研究了基因结构与功能的关系;在DNA复制领域,利用噬菌体突变株和体外系统阐明了DNA复制机制;在结构生物学方面,通过噬菌体装配研究揭示了生物大分子自组装原理;在基因表达调控方面,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术揭示了病毒蛋白合成的时序性,并最终导致RNA聚合酶σ因子的发现。 [4]1954年,雅各布和沃尔曼发现"合子诱导"现象:当含有λ原噬菌体的Hfr菌株与非溶源受体接合时,原噬菌体会被激活并导致受体细胞裂解。 [4]
坎贝尔于1962年提出的整合模型阐明了λ噬菌体DNA通过位点特异性重组插入宿主染色体的分子机制。该模型解释了:(1)噬菌体基因组的环化过程;(2)att位点的同源重符船求组;(3)整合状态与游离状态基因顺序的差异。这些研究还导致发现λ的阻遏蛋白系统,成为基因协同调控的经典范例。溶源性噬菌体研究还揭示了病毒介导的基因转移现象:P22噬菌体展示了普遍性转导(可传递任何宿主基因),而λ噬菌体则呈现特殊性转导(仅传递特定邻近基因)。这些发现不仅丰富了遗传学研究手段,更拓展了对遗传物质流动的认知。 [4]

生物学性状

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形态与结构

噬菌体
噬菌体很小,在光镜下不可见,需用电镜观察。不同的菌体在电镜下有三种形态:蝌蚪形、微球形及丝形。大多数菌体呈蝌蚪形,由头部和尾部两部分组成。 [5]头部呈六边形立体对称,由蛋白质衣壳包绕核酸组成;尾部是一管状结构,由中空的尾髓和外面包裹的尾鞘组成,尾髓具有收缩功能,可将头部的核酸注入宿主菌细胞内。尾部末端有尾板、尾刺和尾丝。其中尾丝为吸附器官,能识别宿主菌体表面的特异性受体。 [6]

化学组成

噬菌体的化学成分是由蛋白质包裹的外壳和内部的核酸两部分构成。核酸存在于头部,大部分菌体的DNA是双链,蛋白质组成头部的外壳和尾部。 [5]

耐受性

噬菌体对理化因素及多数化学消毒剂的抵抗力比一般细菌的繁殖体强。噬菌体能耐受低温和冰冻,但对紫外线和X线敏感。 [5]在温度方面,噬菌体最适生长温度范围通常与宿主菌基本一致,但热稳定性明显高于宿主菌。大多数噬菌体的热失活温度在60-80℃之间,部分耐热性强的噬菌体可耐受更高温度,而少数对温度较为敏感的噬菌体则在50-60℃即会失活。这种温度特性使得噬菌体在宿主菌被高温杀灭后仍可能保持一定活性。 [14]

分布

噬菌体在自然界中分布广泛,主要存在于细菌(包括放线菌)富集的环境。以植物病原菌为例:水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)的噬菌体普遍存在于染病植株的叶片、谷粒、稻桩等组织,以及田间水体和土壤中;柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri)的噬菌体则常见于染病果树的果实表面、叶片、苗木及果园土壤和杂草表面。这些存在大量宿主菌的生态环境通常都能成功分离到相应的噬菌体。 [14]

存活状态

噬菌体在自然界中的数量变化呈现明显的动态特征,其消长规律与宿主菌密切相关:当宿主菌大量繁殖时,噬菌体随之快速增殖;而当宿主菌数量减少时,噬菌体数量也相应下降。然而,噬菌体的存活还受到多种环境因素的影响,包括日光、紫外线等物理因素,以及表面活性剂、农药、酸碱和强氧化剂等化学物质。由于噬菌体对这些理化因素高度敏感,在不利环境条件下容易发生钝化失活现象。这种双重依赖性(宿主菌数量和环境条件)决定了噬菌体在自然界中的分布和存活状态。 [14]

血清学反应

噬菌体具有抗原性,能刺激机体产生特异性抗体。 [5]此外,噬菌体的血清学反应主要表现为特异性的中和反应,其抗血清能够使相应的噬菌体失活,这种反应具有高度专一性。基于这一特性,血清中和反应被广泛应用于噬菌体株系的鉴别鉴定以及特定生物学性状的研究。该反应机制与其他病毒的血清学反应类似,是研究噬菌体分类和功能的重要工具。 [14]

分类

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按感染结果

根据感染细菌导致的不同结果可将噬菌体分为毒性噬菌体(virulent phage)和温和噬菌体(temperate phage)。 [5]
毒性噬菌体
毒性噬菌体通过溶菌周期在宿主菌内完成增殖过程,该周期始于噬菌体特异性吸附于宿主菌表面受体,随后将其遗传物质穿入菌体内部。在宿主细胞内,噬菌体利用细菌的生物合成系统进行病毒核酸的复制和结构蛋白的合成,这些新合成的病毒组分通过自组装形成成熟的子代噬菌体颗粒。最终,随着大量子代噬菌体的产生,宿主菌细胞被裂解释放出新生病毒颗粒,完成从吸附到释放的完整复制周期。 [5]
温和噬菌体
温和噬菌体具有独特的双相生命周期,其基因组能够整合至宿主菌染色体形成前噬菌体(prophage),随宿主复制而稳定遗传,建立溶原性周期(lysogenic cycle)。携带前噬菌体的溶原性细菌可获得新的表型特征,这种现象称为溶原性转换(lysogenic conversion),典型实例包括:白喉棒状杆菌经β噬菌体感染后获得外毒素合成能力;A群链球菌通过溶原化产生致热外毒素;沙门菌特定O抗原的表达亦依赖前噬菌体编码的修饰酶。这些获得性性状会随前噬菌体的丢失而消失。温和噬菌体在特定条件下(如紫外线诱导)可从前噬菌体状态进入溶菌性周期(lytic cycle),启动病毒复制并最终裂解宿主细胞。 [5]

按蛋白质结构

无尾部结构的二十面体:这种噬菌体为一个二十面体,外表由规律排列的蛋白亚单位——衣壳组成,核酸则被包裹在内部。 [7]
有尾部结构的二十面体:这种噬菌体除了一个二十面体的头部外,还有由一个中空的针状结构及外鞘组成的尾部,以及尾丝和尾针组成的基部。 [7]
线状体:这种噬菌体呈线状,没有明显的头部结构,而是由壳粒组成的盘旋状结构。 [7]

按核酸特点

ssRNA:噬菌体中所含的核酸是单链RNA [13]
dsRNA:噬菌体中所含的核酸是双链RNA [13]
ssDNA:噬菌体中所含的核酸是单链DNA [13]
dsDNA:噬菌体中所含的核酸是双链DNA [13]

溶菌过程

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溶菌过程
噬菌体具有严格的宿主特异性,通常只作用于特定种类或型别的微生物。其感染宿主后可产生两种不同结果:一是噬菌体在宿主细胞内进行增殖;二是噬菌体不进行增殖,而是以潜伏状态存在于宿主细胞内,这种现象称为溶原状态,此类噬菌体称为溶原性噬菌体。当噬菌体感染导致宿主细胞裂解时,其过程可分为五个连续阶段:吸附、侵入、增殖、成熟以及释放。 [8]

吸附

吸附是噬菌体感染宿主细胞的第一步,具有高度专一性,菌体可能因布朗运动或随机碰撞等方式,通过静电引力而与宿主细胞的表面接触。而寄主细胞壁上有一些具有特定化学组成的区域,作为菌体吸附的特异性受点,菌体的末端尾丝散开,固着于受点上,随之刺突与基片也固定上去。 [8]

侵入

噬菌体的侵入机制具有宿主特异性,主要取决于宿主细胞表面结构。以大肠杆菌T4噬菌体为例,其侵入过程包括以下关键步骤:首先,噬菌体尾部释放溶菌酶,特异性水解宿主细胞壁的肽聚糖层,形成穿透孔道;随后,噬菌体尾鞘收缩,将尾髓插入细胞内部;最后,噬菌体头部的核酸通过尾髓通道注入宿主细胞内,而蛋白质外壳则留在细胞外并最终降解。 [8]

增殖

噬菌体感染宿主细胞后,病毒核酸释放至宿主细胞质中,原有病毒颗粒解体并丧失感染性,进入潜伏期(黑暗期)。在此阶段,宿主细胞的正常代谢发生显著改变,其生物合成活动转由噬菌体核酸(DNA或RNA)携带的遗传信息调控。噬菌体利用宿主细胞的合成机制,一方面大量复制自身核酸,另一方面合成病毒特异性蛋白质,为后续病毒颗粒的组装提供物质基础。 [8]

成熟

噬菌体的装配过程遵循严格的程序化组装机制。以大肠杆菌T4噬菌体为例:首先,病毒DNA分子聚缩形成致密的多角体结构;随后,头部外壳蛋白通过精确的分子识别与空间排布,将浓缩的DNA核心包裹,形成完整的头部结构;最后,尾鞘、尾丝等附属结构按特定顺序依次装配到头部,最终形成具有感染能力的成熟子代噬菌体颗粒。 [8]

释放

噬菌体增殖周期的释放阶段具有以下特征:当子代噬菌体在宿主细胞内完成装配后,会诱导宿主细胞壁破裂,释放出大量具有感染能力的噬菌体颗粒。不同噬菌体的增殖周期时长存在显著差异,从十几分钟到数小时不等,其中感染放线菌的噬菌体通常需要更长的增殖时间。噬菌体裂解宿主细胞的现象是其繁殖的直接结果:在液体培养中表现为浑浊菌液变澄清,在固体培养基上则形成特征性的噬菌斑。 [8]

细菌防御方法

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细菌防御噬菌体的主要方法是合成能够降解外来DNA的酶。这些酶被称为限制性内切酶,它们能够剪切噬菌体注入细菌细胞的病毒DNA。细菌还含有另一个防御系统,这一系统利用规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,简称CRISPR)来保留其过去曾经遇到过的病毒的基因组片段,从而使得它们能够通过RNA干扰的方式来阻断病毒的复制。这种遗传系统为细菌提供了一个类似于获得性免疫的机制来对抗病毒感染。 [11-12]

危害

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噬菌体在自然界中分布极为广泛,凡是存在细菌和放线菌的环境中都能发现它们的身影。这些病毒对发酵工业构成严重威胁,在食品发酵(如干酪、乳酸生产)、抗生素制造、微生物农药和有机溶剂发酵等生产过程中都可能造成危害。一旦生产菌种被噬菌体污染,就会导致菌体溶解、发酵停止、产物无法积累等严重后果,使整个发酵过程遭到破坏。对于已被噬菌体污染的发酵液,尚无法阻止其溶菌作用,因此预防感染是唯一的应对之策。 [8]

应用

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细菌鉴定和分型

疾病诊断
菌体因其严格的种型特异性,已成为细菌分类鉴定的重要工具。这种特异性表现为:特定噬菌体只能裂解对应细菌种类的特定型别。目前,该技术已成功应用于临床重要病原体的分型,如将金黄色葡萄球菌划分为132个噬菌体型,伤寒沙门氏菌分为72个噬菌体型。 [9]

诊断和治疗疾病

噬菌体在细菌检测和治疗中具有独特应用价值。在检测方面,利用噬菌体只能感染特定细菌的特性,可通过将已知噬菌体加入待测样本后观察效价增长来判断目标菌的存在。 [9]在治疗领域,噬菌体因其严格的种属特异性和细菌难以产生耐受的特性,已成为极具潜力的新型抗菌剂。它们特别适用于治疗金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等易产生多重耐药性的病原菌感染。与常规抗生素不同,噬菌体能够精准靶向特定细菌,且细菌对其产生抗性的概率较低,这为解决日益严峻的抗生素耐药问题提供了新的治疗思路,展现出良好的临床应用前景。 [10]

分子生物学研究

原理
噬菌体展示技术(phage display techniques,PDT)是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达,融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在菌体表面。 [16]
将多样性可变区基因组装到表达载体内,表达到菌体表面得到多样性噬菌体抗体的集合即噬菌体抗体库(phage antibody librany),通过“吸附一洗脱一扩增”的富集过程,可极为有效地从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体的可变区基因。 [15]根据噬菌体的不同,噬菌体展示系统可以分为M13噬菌体展示系统、λ菌体展示系统、T4菌体展示系统、T7噬菌体展示系统等。 [17]
筛选方法
噬菌体展示文库的筛选方法包括固相筛选法和液相筛选法。固相筛选法是将抗体预先偶联或包被到固相载体上,如聚苯乙烯微孔板、顺磁性微球等,再与噬菌体文库反应中收集结合到固相载体上的噬菌体。液相选法是直接将抗体或偶联生物素的抗体加入到菌体文库,预先通过液相免疫反应完成抗体与菌体的充分结合,再在溶液中加入蛋白A/蛋白G偶联的凝胶微球或亲合素偶联的顺磁微球,将抗体及其结合的展示噬菌体进行分离收集。 [17]
技术优势
噬菌体展示技术的优势主要体现在三个方面:首先,该技术能够确保展示的外源蛋白保持完整的生物学活性和天然构象;其次,通过高效的亲和吸附方法,可以从庞大库容中特异性富集极低丰度的靶标克隆,且无需预先了解配体的结构信息,这一特点显著拓宽了技术的应用范围;最后,该技术实现了外源靶蛋白与其编码基因在单个噬菌体颗粒中的共定位,这种基因型与表型的直接关联为后续的基因序列分析和功能研究提供了极大便利。 [18]
具体应用
噬菌体展示肽库技术可广泛应用于抗原-抗体系统、细胞因子-受体相互作用及酶学研究。该技术可选择的靶物质类型多样,包括抗体、酶、受体等特定功能蛋白,也可拓展至细胞、血清乃至整个动物。例如以单克隆抗体模拟抗原表位、模拟细胞因子受体等其他分子的表位等, [20]此外也应用于基因治疗载体、肿瘤的靶向治疗等方面的研究 [19]