質粒

質粒是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區DNA原有的能夠自主複製的較小的DNA分子(即細胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的質粒雖然都是環狀構型，它存在於許多細菌以及酵母菌等生物中，乃至於植物的葉綠體和線粒體等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天藍色鏈黴菌)等放線菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋體)等原核生物中，又相繼發現線形質粒。

天然質粒的DNA長度從數千鹼基對至數十萬鹼基對都有。質粒天然存在於這些生物裏面，有時候一個細胞裏面可以同時有一種乃至於數種的質粒同時存在。質粒的套數(copy number)在細胞裏從單一到數千都有可能。有時有些質粒含有某種抗藥基因(如大腸桿菌中就有含有抗四環素基因的質粒)。有一些質粒攜帶的基因則可以賦予細胞額外的生理代謝能力，乃至於在一些細菌中提高它的致病力。一般來説，質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的作用。它是基因工程最常見的運載體。

根據質粒能否通過細菌的接合作用，可分為接合性質粒和非接合性質粒。接合性質粒帶有與接合傳遞有關的基因。非接合質粒在一定條件下通過與其共存的接合質粒的誘動或轉導而傳遞。

根據質粒在細菌內的複製類型可分為兩類：嚴緊控制型和鬆弛控制型。嚴緊控制複製型質粒的複製酶系與染色體DNA複製共用，只能在細胞週期的一定階段進行復制，當細胞染色體停止複製時，質粒也就不再複製。鬆弛控制複製型的質粒的複製酶系不受染色體DNA複製酶系的影響，在整個細胞生長週期中隨時都可以複製，在染色體複製已經停止時質粒仍能繼續複製。

根據質粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。不相容性指結構相似、密切相關的質粒不能穩定地共存於同一宿主細菌內的現象，反之為相容性。常用於流行病學的調查。

1、抗性質粒:它們帶有抗性基因，可使宿主菌對某些抗菌素產生抗性，如對氨基苄青黴素，氯黴素等產生抗性。不同的細菌中也可含有相同的抗性質粒，如RP4質粒在假單胞菌屬和其它細菌中都存在。R質粒還可以通過感染的形式在不同種的細菌中傳播。

2、致育因子:可以通過接合在供體和受體間傳遞遺傳物質。F因子約有1/3的DNA構成一個轉移DNA的操縱子，約35個基因，負責合成和裝配性傘毛。這就是DNA轉移區域，受traJ基因產物的正調節。它還具有重組區和複製區。重組區含有多個插入順序，通過這些插入順序進行同源重組。在複製區有兩個複製起始點:一個是OriV，供給F因子在宿主中自主複製時使用;另一個是OriT，供接合時進行滾環複製的起始點。

3、Col質粒:帶有編碼大腸桿菌素的基因。大腸桿菌素可殺死其它細菌。

4、降解質粒:這種質粒編碼一種特殊蛋白，可使宿主菌代謝特殊的分子，如甲苯或水楊酸。

5、侵入性質粒:這些質粒使宿主菌具有致病的能力。如Ti質粒，此是在根癌農桿菌中發現的，現經過加工用來作植物轉基因的一種常用載體。

6、隱秘質粒:不顯示任何表現類型，主要通過物理方法才能發現。（如酵母菌2微米質粒）

大腸桿菌質粒的分子結構示意圖質粒在細胞內的複製一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和鬆弛控制型(Relaxed control)。前者只在細胞週期的一定階段進行復制，當染色體不復制時，它也不能複製，通常每個細胞內只含有一個或幾個質粒分子，如F因子。後者的質粒在整個細胞週期中隨時可以複製，在每個細胞中有許多拷貝，一般在20個以上，如 Col E1質粒。在使用蛋白質合成抑制劑-氯黴素時，細胞內蛋白質合成、染色體DNA複製和細胞分裂均受到抑制，緊密型質粒複製停止，而鬆弛型質粒繼續複製，質粒拷貝數可由原來20多個擴增至1000-3000個，此時質粒DNA佔總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。利用同一複製系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質粒同時導入同一細胞時，它們在複製及隨後分配到子細胞的過程中彼此競爭，在一些細胞中，一種質粒佔優勢，而在另一些細胞中另一種質粒卻佔上風。當細胞生長几代後，佔少數的質粒將會丟失，因而在細胞後代中只有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性(Incompatibility)。

把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質粒是重組DNA 技術中常用的載體。質粒分子本身是含有複製功能的遺傳結構。質粒還帶有某些遺傳信息，所以會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。其自我複製能力及所攜帶的遺傳信息在重組DNA操作，如擴增、篩選過程中都是極為有用的。

質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質粒相比，質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列，並去掉了大部分非必需序列，使分子量儘可能減少，以便於基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑑定重組克隆、產生用於序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA序列、鑑定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性:⑴分子量小、多拷貝、鬆弛控制型;⑵具有多種常用的限制性內切酶的單切點;⑶能插入較大的外源DNA片段;⑷具有兩個以上的遺傳標記物，便於鑑定和篩選。⑸對宿主細胞無害。常用的質粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列、PET系列和pBluescript(簡稱pBS)等。

利用同一複製系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質粒同時導入同一細胞時, 它們在複製及隨後分配到子細胞的過程中彼此競爭。在一些細胞中，一種質粒佔優勢，而在另一些細胞中另一種質粒卻佔上風。當細胞生長几代後，佔少數的質粒將會丟失，因而在細胞後代中只有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同複製系統的質粒則可以穩定地共存於同一宿主細胞中。質粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包括對抗生素的抗性，產生某些抗生素，降解複雜有機物，產生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內切酶與修飾酶等。

從細菌中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟:培養細菌使質粒擴增;收集和裂解細胞;分離和純化質粒DNA。採用強鹼液、加熱或溶菌酶(主要針對革蘭氏陽性細菌)可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS)和TritonX-100(一般很少使用)可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS或Triton X-100處理後，細菌染色體DNA會纏繞附着在細胞碎片上，同時由於細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、鹼處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，並以溶解狀態存在於液相中。在細菌細胞內，共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成鬆弛型的環狀分子，稱開環DNA(Open circularDNA，簡稱ocDNA);如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA)。當提取的質粒DNA電泳時，同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。

質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立於細菌擬核DNA之外，並具有自我複製能力的很小的雙鏈環狀DNA分子。在基因工程中質粒常被用做目的基因的載體(Vector)。質粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中。攜帶外源DNA片段的質粒進入受體細胞後，在細胞中進行自我複製，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA同步複製。質粒DNA分子上有特殊的標記基因，如四環素抗性基因，氨苄青黴素抗性基因等標記基因，供重組DNA的鑑定和選擇。

已發現有質粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質粒的相對分子質量一般較小，約為細菌擬核的0.5%~3%。根據相對分子質量的大小，大致上可以把質粒分成大小兩類:較大一類的相對分子質量是40×106以上，較小一類的相對分子質量是10×106以下(少數質粒的相對分子質量介於兩者之間)。每個細胞中的質粒數主要決定於質粒本身的複製特性。按照複製性質，可以把質粒分為兩類:一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體複製一次時，質粒也複製一次，每個細胞內只有1~2個質粒;另一類是鬆弛型質粒，當染色體複製停止後仍然能繼續複製，每一個細胞內一般有20個左右質粒。這些質粒的複製是在寄主細胞的鬆弛控制之下的，每個細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還會使質粒拷貝數增至幾千份。如較早的質粒pBR322即屬於鬆弛型質粒，要經過氯黴素處理才能達到更高拷貝數。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型。分子量較小的質粒屬鬆弛型。質粒的複製有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸桿菌內的複製屬嚴緊型，而在變形桿菌內則屬鬆弛型。

在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。人工構建的質粒可以集多種有用的特徵於一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環素基因(Tcr)和抗氨苄青黴素基因(Apr)，並含有27種限制性內切酶的單一識別位點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到Hind Ⅲ、Bam H I 或 Sal I切點，就會使抗四環素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨苄青黴素，但對四環素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨苄青黴素又抗四環素，而沒有pBR322質粒的細菌將對氨苄青黴素和四環素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨苄青黴素基因和PstI切點。質粒運載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千鹼基對)。

1973年，科學家將質粒作為基因的載體使用，為基因工程的誕生奠定了基礎。

最常用的質粒是大腸桿菌的質粒。這種質粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那黴素抗性基因。

pBR322質粒

pBR322質粒DNA分子的長度為4361bp*(*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.)，此載體中有兩個標記基因，一個是氨苄青黴素抗性基因(Apr)，另一個是四環素抗性基因(Tetr)。已知pBR322DNA分子共有24種核酸內切限制酶的單一識別位點。其中7種限制酶(從12:00位置按順時針方向)即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaⅢ和NruI的識別位點位於四環素抗性基因內部，另外有2 種限制酶即ClaI和HindⅢ的識別位點是存在於這個基因的啓動區內，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導致tetr的失活。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識別位點位於氨苄青黴素抗性基因內，在這些位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。由pBR322質粒載體的結構可知其具有如下優點:⑴具有較小的分子量。經驗表明，為了避免在DNA的純化過程中發生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。pBR322質粒這種小分子量的特點，不僅易於自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段;⑵具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號，能指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型，這種轉化細胞可明顯地區別於非轉化細胞。當我們把一個DNA片段插入到某一個標記基因內時，該基因就失去了相應的功能。當把這種重組DNA分子轉到宿主細胞後，該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉化細胞，細胞內含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那麼這種載體必須至少具有兩個標記基因。另外，pBR322質粒載體還具較高的拷貝數，而且經過氯黴素擴增之後，每個細胞中可積累1000~3000個拷貝，這就為重組體DNA的製備提供了極大的方便。

pBR322質粒載體的構建過程可簡單地概括如下:

1、由於pBR322質粒的親本之一是pMB1質粒，故首先以pMB1為基礎，引入Rldrd19質粒的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3質粒;

2、pMB3的分子量顯然使得它不適合作為載體，所以要通過在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無用片段失去，留下來的小片段的DNA的黏性末端連接起來後就形成了pMB8質粒(2.6kb);

3、此時，另外一種pSC101質粒在EcoRI活性條件下消化產生了含有tetr抗性的DNA片斷，這個片斷和pMB8整合在一起就形成了pMB9質粒(5.3kb)。此時pMB9為ampstetr表型;

4、pMB9已經初步具備載體的功能，為了讓它更加完善，我們要讓它具備amprtetr性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以來也可以走，為了留住它，我們切去了Tn3中表達轉位酶的基因，形成了pBR313質粒。

此後我們兵分兩路:一路把pBR313的PstI位點除去，使之成為ampstetr表型的pBR318質粒;

5、;另一路把pBR313的EcoRⅡ的位點切除，使之成為amprtets表形的pBR320質粒。

由此我們的到了兩種功能互補的質粒，這樣我們只要將他們雜交就可以得到一種接近全能的載體質粒了，這就是pBR322。

瞭解了pBR322的結構和它的構建過程之後，我們來看pBR322在基因工程中的應用。

pBR322質粒作為一種常用的基因克隆載體，在實際應用中有着非常重要的地位，其中一個突出的例子就是應用pBR322 作為克隆載體對水稻的葉綠體光誘導基因psbA 進行結構分析。

將水稻葉綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內切酶消化之後，放入含有溴化乙錠的低熔點(LMP)的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.8~2.5kb之間的DNA片段，再與同樣經過了EcoRI核酸限制性內切酶切割並用鹼性磷酸酶作了脱磷酸處理的pBR322質粒連接。然後，將混合物轉化到大腸桿菌5346菌株，培養在氨苄青黴素選擇平板上，形成Ampr轉化子菌落羣體。這樣就構成了由EcoRI核酸限制性內切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫。用Ampr轉化子菌落與32P放射性標記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質粒DNA，經過進一步的分析，就能測出水稻葉綠體基因psbA的序列。

利用pBR322作為載體重組人體的抑生長激素也是一個經常提到的應用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小異，只是除了在質粒載體上插入抑生長激素基因外，還將含有lac操縱子起始部分的片段(包括啓動子、操縱區、核糖體結合位點和β-半乳糖苷酶的主要部分)插在抑生長激素基因的旁邊。由於有了lac操縱子的控制，重組基因產生的蛋白質的調節就變得比較容易了。

質粒具有自主複製能力，使其在子代細胞中也能保持恆定的拷貝數，並表達所攜帶的遺傳信息。細菌質粒是DNA重組技術中常用的載體。載體是指把一個有用的外源基因通過基因工程手段，送進受體細胞中去進行增殖和表達的工具。將某種目標基因片段重組到質粒中，構成重組基因或重組體。然後將這種重組體經微生物學的轉化技術，轉入受體細胞（如大腸桿菌）中，使重組體中的目標基因在受體菌中得以繁殖或表達，從而改變寄主細胞原有的性狀或產生新的物質。