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重組質粒

鎖定
目的基因,有質粒,然後用使兩者相接就是重組質粒,重組質粒是一個種動作,方法,也是一個名詞
中文名
重組質粒
原    料
目的基因

重組質粒基本信息

質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(<10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上説是很簡單的,先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段, 然後體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區分插入有外源DNA的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步採取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑑別重組子和非重組子。

重組質粒反應策略

帶有非互補突出端的片段
外源DNA片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種:
1、帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的黏 [1]  性末端,這也是最容易克隆的DNA片段,一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點,因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體,從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時,在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。
帶有相同的黏性末端
2、帶有相同的黏性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由於質粒載體也必須用同一種酶消化,亦得到同樣的兩個相同粘性末端,因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以,必須仔細調整連接反應中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團用鹼性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質粒DNA的自身環化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生一個帶有兩個缺口的開環分子,在轉入大腸桿菌(E. coli)受體菌後的擴增過程中缺口可自動修復。
帶有平末端
3、帶有平末端 是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生,或由DNA聚合酶補平所致。由於平端的連接效率比黏性末端要低得多,故在其連接反應中,T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。
特殊情況下
外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端後再進行連接。
參考資料
  • 1.    人民教育出版社課程教材研究所生物課程教材研究開發中心.普通高中課程標準實驗教科書生物必修2遺傳與進化.北京:人民教育出版社,2007:102