核酸診斷

基因診斷的主要技術有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應、恆温擴增、基因測序和生物芯片技術。

1.1 原理： 具有一定互補序列和核苷酸單鏈在液相或固相中按鹼基互補配對原則締合成異質雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測核酸序列和探針序列。應用該技術可對特定DNA或RNA序列進行定性或定量檢測。

1.2 基因探針及其標記： 基因探針是一段與待測DNA或RNA互補的核苷酸序列，可以是DNA或RNA，長度不一，可為完整基因，也可為其中一部分。根據探針的來源和性質分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針。作為探針至少必須滿足兩個條件，一是應為單鏈（或通過變性形成單鏈），二是應帶有可被示蹤和檢測的標記。有了合適的探針，就有可能檢測出目的基因，觀察有無突變，也可根據探針的結合量進行定量檢測。選擇探針最基本的原則是要有高度特異性，其次也需考慮到製備探針的難易性和檢測手段的靈敏性等其他因素。

1.3 常用核酸分子雜交技術： ① Southern印跡雜交；② Northern印跡雜交；③斑點雜交（dot blotting）；④原位雜交（in-situ hybridization）；⑤夾心雜交（三明治雜交）；⑥液相雜交。

恆温擴增技術主要包括鏈置換擴增法( strand displacement amplification , SDA) 、核酸序列擴增法( nucleic acid sequence-based amplification ,NASBA) 、轉錄介導擴增法( Transcription Mediated Amplification , TMA) 和滾環擴增法(RollingCircle Amplification ,RCA) 以及環介導等温擴增法(Loop-mediated isothermal amplification , LAMP)等。

LAMP是Notomi 等在2000 年開發的一種新穎的恆温核酸擴增方法,即環介導等温擴增法( loop-mediated isot hermalamplification , LAMP) ,其特點是針對靶基因的6 個區域設計4 種特異引物,利用一種鏈置換DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温條件(65 ℃左右) 保温幾十分鐘,即可完成核酸擴增反應。不需要模板的熱變性、長時間温度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP 是一種嶄新的DNA 擴增方法,具有簡單、快速、特異性強的特點,具有替代PCR 方法的可能性。

（Re?sequencing），基於 ^[1]  分子病理的醫學基因測序在醫療機構中的實驗室建設尚十分薄弱，其原因之一在於臨牀病理基因診斷的操作技術複雜、知識基礎不足，可在很大程度上自動、準確地完成數萬種不同類型的基因測序、突變檢測。臨牀基因測序檢測對病理科的形態診斷金標準含金量的提升和分子病理技術的開發及經濟效益改善有現實意義。2年多來，我們完成了十多種病理基因測序及片段分析共1 100例的檢測，體會如下：組織和血液DNA抽提成功率100%，石蠟標本首次抽提成功率80%，關鍵環節在於選用DNA抽提試劑盒，用中性甲醛固定時間＜48 h，充分洗脱甲醛且消化徹底；結果顯示基線平整，各鹼基平均信號強度（Ave Signal Intensity）在200~1 000之間，噪音（Noise）＜5，Raw基線接近0[1]。（基因測序結果如圖1~3）；測序質量控制要點：模板DNA質量要高；PCR要求條帶單一，但拷貝量要求不高；PCR產物一定要經過純化處理，測序反應後推薦用酒精/NaAc法再純化；電泳毛細管需定期養護和灌膠；通過檢測腫瘤及相關基因的序列，總結出開展基因測序項目在病理外檢中有如下幾點臨牀應用意義：對於可疑癌前病變患者可以明確其病變標本是否真正含有候選基因的突變，以解除大量由免疫組化標記癌基因陽性患者的心理恐慌和經濟負擔[2]。對病理切片平面局部未能反映的淋巴結轉移，通過全淋巴結組織DNA溶膠K?RAS癌基因測序，輔助檢測臨牀微轉移現象。鑑定心腦血管疾病APOE基因多態性6種基因表型，ε4高危類型與高脂血症、冠心病、腦血管病和老年性痴呆有關。對癌症家族有血緣關係的親屬檢測相關癌基因突變或多態性，具有亞健康診斷和體檢意義。對腫瘤分子靶向藥物治療檢測C?kit[3]和EGFR 18、19、21外顯子突變具有癌症治療的積極意義[4~7]。YMDD突變檢測乙肝病毒對拉米呋定的耐藥性。

它們是DNA雜交探針技術與半導體工業技術相結合的結晶。該技術係指將大量探針分子固定於支持物上後與帶熒光標記的DNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息。

生物芯片技術起源於核酸分子雜交。所謂生物芯片一般指高密度固定在互相支持介質上的生物信息分子（如基因片段、CDNA片段或多肽、蛋白質）的微陣列雜交型芯片（micro-arrays），陣列中每個分子的序列及位置都是已知的，並且是預先設定好的序列點陣。微流控芯片（microfluidic chips）和液態生物芯片是比微陣列芯片後發展的生物芯片新技術，生物芯片技術是系統生物技術的基本內容。

什麼是生物芯片呢？簡單説，生物芯片就是在一塊玻璃片、硅片、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然後由一種儀器收集信號，用計算機分析數據結果。

人們可能很容易把生物芯片與電子芯片聯繫起來，雖然，生物芯片和電子芯片確實有着千絲萬縷的聯繫，但它們是完全不同的兩種東西。生物芯片並不等同於電子芯片，只是借用概念，它的原名叫“核酸微陣列”，因為它上面的反應是在交叉的縱列中所發生。

芯片的概念取之於集成的概念，如電子芯片的意思就是把大的東西變成小的東西，集成在一起。生物芯片也是集成，不過是生物材料的集成。像實驗室檢測一樣，在生物芯片上檢查血糖、蛋白、酶活性等，是基於同樣的生物反應原理。所以生物芯片就是一個載體平台。這個平台的材料則有很多種，如硅，玻璃，膜（纖維素膜）等，還有一些三維結構的多聚體，平台上則密密麻麻地擺滿了各種生物材料。芯片只是一個載體。做什麼東西、檢測什麼，還是靠生物學家來完成。也就是説，原來要在很大的實驗室中需要很多個試管的反應，只在一塊小小的芯片上即可完成，實現了高速、便捷的檢測目標。

核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力於研究基因的體外分離技術，Korana 於1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重複該過程便可克隆tRNA基因”。

1983年的一天，美國科學家Kary Mulis驅車在蜿蜒的州際高速公路上行駛中，孕育出了PCR技術的原型。他在實驗上證明了PCR的構想，並於1985年申請了有關PCR的第一個專利，在Science雜誌上發表了第一篇PCR的學術論文。從此PCR技術得到了生命科學界的普遍認可，Kary Mulis也因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶 I的Klenow片段，其缺點是酶不耐高温，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。 1988年Saiki等人從温泉中分離的一株水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶，克服了這個缺點，從而使PCR技術得到了廣泛的應用，也使PCR成為遺傳與分子分析的根本性基石。

經過十幾年的發展，PCR成為實驗室的常規技術。它是現代分子生物學研究中不可缺少的手段，是一種極為敏感的放大系統。相比於傳統的臨牀診斷方法，核酸診斷是分子水平上的診斷技術，可以彌補傳統臨牀診斷方法的某些缺陷，比如，核酸診斷能直接揭示病原體的存在，能客觀反映病原體在人體內感染及活動情況，可以作為臨牀治療中的一個有效監控手段，另外採用核酸診斷技術還可以檢測到常規檢測方法難以檢測到的病原體，例如可以克服酶免檢測技術中從感染到抗體產生的窗口期問題。因此，以PCR技術為代表的核酸診斷技術在臨牀診斷中得到日益廣泛的應用。