cDNA探針

cDNA是由RNA經一種稱為逆轉錄酶（reverse transcriptase）的DNA聚合酶催化產生的，這種逆錄酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒時發現的。該酶以RNA為模板，根據鹼基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）。這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱反向轉錄或逆轉錄。攜帶逆轉錄酶的病毒侵入宿主細胞後，病毒RNA在逆轉錄酶的催化下轉化成雙鏈cDNA，並進而整合人宿主細胞染色體DNA分子，隨宿主細胞DNA複製同時複製。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。

在靜止狀態下，可被複制多代，但不被表達，故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量複製，如其帶有癌基因，還可能誘發細胞癌變，後來發現逆轉錄酶不僅普遍存在於RNA病毒中，而且哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞也含有逆轉錄酶。逆轉錄酶的作用是以dNTP為底物，RNA為模板，tRNA（主要是色氨酸tRNA）為引物，在tRNA3’-OH末端上，5’－3’方向，合成與RNA互補的DNA單鏈，稱為互補DNA（cDNA），單鏈cDNA與模板RNA形成RNA-DNA雜交體。隨後在逆轉錄酶的RNase H活性作用下，將RNA鏈水解成小片段。cDNA單鏈的3’末端回折形成一個小引物末端，逆轉錄酶又以第一條cDNA鏈為模板再合成第二第cDNA鏈，至此，完成逆轉錄全過程，合成雙鏈cDNA。

逆轉錄現在已成為一項重要的分子生物學技術，廣泛用於基因的克隆和表達。從逆轉錄病毒中提取的逆轉錄酶已商品化，最常用的有AMV逆轉錄酶。利用真核mRNA3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)）用作引物，在逆轉錄酶催化下合成互補於mRNA的cDNA鏈，然後再用RNase H將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉錄過程。

所得到的雙鏈cDNA分子經S1核酸酶切平兩端後接一個有限制酶切點的接頭（linker），再經特定的限制酶消化產生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt，EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉化子的文庫，再經前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術獲得的DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用於基因表達的檢測。