探針技術

探針屬於高效分析試劑，其最大特點在於專一性強、靈敏度高。探針技術在生物大分子研究、藥物分析、司法鑑定、臨牀疾病診斷和治療等方面發揮着巨大的作用。基於核酸分子雜交原理的核酸探針是最常見的一類探針，另外還有金屬離子探針和有機小分子探針等。核酸探針　利用核酸分子雜交的特性對特定核酸序列進行檢測。將雜交鏈中的一條用某種可檢測的物質進行標記製成探針，可實現對另一條互補鏈的識別和檢測。由於核酸探針與互補鏈之間的識別作用是通過數十乃至成百上千個位點間的氫鍵結合力和鹼基專一配對作用實現的，因此具有極高的特異性。核酸探針的來源和種類　核酸探針主要有DNA(脱氧核糖核酸)探針、RNA(核糖核酸)探針、cDNA(互補DNA)探針和寡聚核苷酸探針等。前三種核酸探針一般通過分子克隆獲得，因此稱為克隆探針。寡聚核苷酸探針是人工合成的鹼基數較少的DNA片段，屬於短鏈探針。寡聚核苷酸探針的最大優點在於對靶序列變異的識別能力較強，因為短探針中鹼基錯配會導致雜交體的融鏈温度顯著下降，而克隆探針對於單個或少數鹼基不配的兩個序列往往雜交信號相當，難以區分。此外，寡聚核苷酸探針還具有雜交時間短、可一次大量合成和成本低廉等優點。不過，克隆探針的特異性通常比寡聚核苷酸探針強，因為後者序列較短，隨機遇到互補序列的可能性要大。另外克隆探針可標記的位點比寡聚核苷酸探針多，因此可獲得較強的雜交信號，即靈敏度較高。核酸探針的標記　最早採用的標記方法是放射性同位素標記法，常用的放射性同位素有32P、3H和35S等。放射性同位素標記探針靈敏度較高，但由於半衰期限制，標記後存放時間有限，另外對操作者和環境有放射性危害，因而越來越多地被非放射性標記技術所取代。非放射性標記試劑種類豐富，如金屬、熒光染料、地高辛半抗原、生物素和酶等，通過酶促反應、光促反應或化學修飾等方法標記到核酸分子上。常用的核酸探針標記方法有缺口平移法、末端標記法、隨機引物法和聚合酶鏈式反應法(PCR)等。核酸探針的檢測技術　主要有：①傳統印跡雜交法。將參加反應的一條核酸鏈固定在固體支持物（如硝酸纖維素濾膜、微孔板）上，另一條反應核酸鏈遊離在溶液中的檢測方法稱為固相雜交法。傳統的印跡雜交技術是典型的固相雜交檢測法，是將存在於凝膠中的生物大分子轉移（印跡）到固定化介質上後進行檢測分析的技術。轉移的方法有毛細法、電轉移法和真空吸引轉移法等。②實時熒光PCR技術。將熒光標記探針與PCR擴增反應相結合建立的檢測方法。其理論基礎是熒光共振能量轉移（FRET）原理，即當兩個熒光基團靠近時，高能量熒光基團會將受激發後產生的能量轉移到相鄰的低能量熒光基團上。根據標記在探針上的兩種熒光基團所發出熒光信號的變化可以測定PCR擴增產物的數量變化，從而使得熒光PCR技術可以達到實時檢測的目的。TaqMan技術和LightCycler技術都是典型的實時熒光PCR檢測技術。TaqMan技術是利用Taq酶的5′外切酶活性，合成一個能與PCR產物雜交的探針。探針的5′端和3′端分別標記不同的熒光基團，其中3′端的熒光基團能夠吸收5′端熒光基團發出的熒光。這樣在正常情況下只能檢測到3′端熒光基團的熒光信號，而5′端熒光基團發出的熒光是檢測不到的。當溶液中含有目標PCR產物時，探針與產物雜交，激活Taq酶的5′外切酶活性，將探針5′端連接的熒光基團從探針上切割下來，從而發出熒光。切割的熒光基團數與PCR產物的數量成比例。因此根據PCR反應液的熒光強度即可算出初始目標產物的數量。此法標記成本較高，尚未達到普及應用階段。另外，本底較高，酶的性能對定量也有一定影響。LightCycler技術是將熒光基團和猝滅基團分別標記在可與目標物同一條鏈上相鄰序列雜交的兩個不同的探針上，其中熒光基團連接在發光探針的5′端，猝滅基團連接在猝滅探針的3′端。當兩探針與目標鏈雜交時，熒光基團和猝滅基團由於相互靠近發生FRET而使熒光猝滅。熒光猝滅的程度與目標鏈的起始量成正比，以此可以進行PCR定量分析。該方法的特點是猝滅效率高，但由於兩個探針結合於模板上，對擴增效率造成一定影響，另外由於需要合成兩個較長的探針，因此成本相對較高。總的來説，實時熒光PCR比普通PCR省時，定量線性範圍也寬得多，並且減少了擴增產物受污染的可能性。③分子信標技術。是將熒光基團和猝滅基團分別標記在同一探針的5′末端和3′末端，自身形成一個髮卡結構。正常情況下，熒光基團和淬滅基團鄰近，不會產生熒光。當探針在溶液中遇到目標鏈發生雜交反應時，探針的髮卡結構被破壞，溶液便產生熒光。熒光的強度與溶液中目標物的量成正比，因此可用於核酸的定量分析。分子信標結合不同熒光標記可用於基因多突變位點同時分析。④芯片檢測技術。將核酸探針以高密度點陣的形式固定在小型的硅片、玻璃片或尼龍膜等表面上，與樣品中的同源核酸分子雜交，然後採用激光共聚焦顯微鏡或電荷耦合檢測器圖像處理等技術進行檢測，這種陣列式探針檢測技術即所謂的DNA芯片技術。DNA芯片主要包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片。探針微點陣的合成可採用離片合成法，即先製備好單個探針，然後按一定的順序固定在經過特殊處理的固相載體表面。另一種合成方法是原位合成法，即採用特製的多通道自動加樣系統，直接在活化好的固相載體表面合成眾多的寡聚核苷酸探針。此法合成的寡聚核苷酸芯片具有快速、高效、探針密度高等優點，藉助激光共聚焦顯微掃描技術可以對雜交信號進行實時、靈敏、準確的檢測和分析。探針的固相原位合成技術是基因芯片從實驗室走向工業化的關鍵，也是實現高通量、自動化分析檢測的一項重大飛躍。蛋白質芯片是將抗體或抗原分子探針固定在合適的固相載體上，構成蛋白質微陣列，通過特異性的免疫反應來檢測目標物。有機小分子探針　包括：染料探針　有機熒光染料分子除了可作為有色基團共價標記到核酸鏈上構成核酸探針外，還有一些可以通過嵌入、溝區或靜電作用等結合方式與核酸分子相作用，實現對核酸的檢測。重要的染料探針有菲啶和吖啶類、吲哚和咪唑類及碳菁陽離子染料等。溴乙錠、吖啶橙及其二聚物等屬於菲啶和吖啶類熒光探針，主要作為嵌入劑與DNA結合，染料分子中的菲啶環和吖啶環為生色團或熒光團。苯酚基雙(苯並咪唑)和苯乙氧基雙(苯並咪唑)、4,6–二脒基–2–苯基吲哚、4,6–(二咪唑啉–2)–2–苯基吲哚等是典型的吲哚和咪唑類染料。它們的膜滲透性較好，並且選擇性地結合A(腺嘌呤)–T(胸腺嘧啶)鹼基對，可用於活細胞染色、細胞週期研究等。碳菁陽離子染料是較新的一類熒光染料探針，與DNA的作用方式有嵌入型、締合型和共價鍵型等，結合產物的熒光強度大大增強，而遇其他的生物大分子幾乎不染色。碳菁陽離子染料根據所含芳香環分為苯並噻唑、苯並胚唑、吲哚和苯並咪唑類等。噻唑橙和胚唑橙二聚體，稱為TOTO系列染料(又稱菁染料對稱二聚體)，是核酸染色最靈敏和親和力最強的熒光探針，利用光成像和流式細胞光度法可檢測由它們標記的單個核酸分子。蛋白質熒光探針也是一類染料，當吸附或共價結合到蛋白質上時熒光特性會發生變化，從而可以研究蛋白質的結構和測定蛋白質。已報道的蛋白質熒光探針有血管狀黃素、吖啶橙和四磺酸基酞菁–Al(Ⅲ)等。熒光鈣探針　胞液內遊離Ca2+濃度的測定和調控對認識各類細胞的生理活性具有重大意義，以EGTA〔乙二醇–雙(2–氨基乙醚)四乙酸〕為選擇性螯合劑合成的一系列熒光鈣探針試劑在無損傷測定單細胞內遊離Ca2+濃度方面發揮了重要作用。熒光鈣螯合劑探針是在原有基礎上進行了酯化修飾後的產物，酯基團使探針分子的脂溶性明顯增加，可輕鬆透過細胞膜，然後在細胞內酯酶的作用下水解轉化成對Ca2+敏感的羧酸形式，實現對Ca2+的選擇性檢測。用激光共聚焦顯微鏡可以觀察細胞內不同部位Ca2＋濃度的變化情況。光散射染料探針　大多為三苯甲烷類，如溴酚藍、鉻天青、鋁試劑和四碘酚磺酞等，均屬於非聯苯型三苯甲烷試劑；溴連苯三酚紅、茜素紫和茜素菁綠等屬於聯苯型染料。一些水溶性卟啉試劑和偶氮類試劑也具有光散射染料探針的性質。這類探針的共同特點是含有帶電荷的親水性基團，如酚羥基、羧基或磺酸基及不帶電的疏水基團，與蛋白質之間以非共價鍵形式結合，根據光散射信號的增加可實現對蛋白質的測定。另外還可用來測定金屬和核酸。大環化合物探針　一些大環化合物如冠醚、大環多胺和杯芳烴等以金屬離子–配體和金屬離子結合位點組裝等作用方式，對某些有重要生理意義的陽離子表現出高選擇性識別能力，可作為相應金屬活性陽離子的檢測探針。離子探針　利用過渡金屬離子作為離子探針，可通過光譜和波譜手段檢測某些重要生物大分子中所含金屬離子所處的構象、價態、環境和對稱性等性質，探明其在生命過程中的重要功能。離子探針的關鍵在於替換生物分子中原金屬離子後，仍能保持生物大分子的基本活性，並具有特徵的檢測信號。離子探針既包括遊離（水合離子）形式，也可以是絡離子形式。根據檢測信息的特徵則可分為紫外–可見吸收探針、磁共振探針、熒光光譜探針、圓二色譜探針和穆斯堡爾探針等。稀土熒光探針是一類重要的離子探針，三價鑭系稀土離子Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)的水溶液均具有熒光，且靈敏度很高，常作為生物大分子的探針，用來研究生物大分子（如蛋白質）的構象，確定生物大分子中金屬離子的結合部位及其與生色基團的距離，還可測定競爭離子與生物大分子結合的離解常數等。由於稀土熒光探針譜線窄、壽命長（稀土熒光壽命通常為10～1 000微秒，而生物樣品本底熒光壽命只有1～20納秒），非常有利於消除生物樣品的背景干擾，在藥物分析中得到廣泛應用。金屬絡離子探針主要有稀土絡離子熒光探針和過渡金屬絡離子探針。稀土離子與有機小分子配位體形成絡合物後，化學性質發生變化，絡合物激發態壽命進一步增加，熒光強度也增加。常見的配位體有乙二胺四乙酸和HEDDA〔N,N–二(2–羥乙基)乙二胺–N,N–乙酸〕等氨羧類絡合劑，水楊酸、聯吡啶等芳香羧酸類，β–二酮類螯合劑和杯芳烴等大環配位體等。雙功能螯合劑稀土絡離子探針及其相應的時間分辨熒光免疫分析方法在臨牀檢驗中已得到廣泛應用。常見的過渡金屬絡離子如Pt(Ⅱ)和Ru(Ⅱ)等可作為發光探針或熒光探針，通過嵌入方式鍵合到DNA或RNA分子上，稱為金屬嵌入劑，是一類重要的離子探針。Ru(bpy)2(dppz)2+{二(2,2′–聯吡啶)–二吡啶〔3,2–a∶2′,3′–c〕並吩嗪釕}對核酸表現出優良的絡離子熒光探針性能，被稱為DNA分子的“光開關”。Os(Phen)2(dppz)2+{二鄰菲羅啉–二吡啶〔3,2–a∶2′,3′–c〕並吩嗪鋨}是在前者基礎上合成的另一種DNA分子“光開關”，是唯一在紅外光區發射熒光的DNA探針。某些金屬離子與卟啉的絡合物也能通過嵌入的方式與蛋白質和DNA相互作用，成為一類有用的金屬絡離子探針。推薦書目　張華山,王紅,趙媛媛.分子探針與檢測試劑.北京:科學出版社,2002. ^[1]