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雙向電泳
鎖定
- 中文名
- 雙向電泳
- 外文名
- two-dimensional electrophoresis,2-DE
- 組 成
- 等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合
- 研究方向
- 蛋白質組研究
- 創建者
- O’Farrell’s
- 創建時間
- 1975
雙向電泳原理
蛋白質首先在薄條凝膠中通過等電聚焦分離。然後將凝膠水平放置在第二個平板狀凝膠上,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質。水平分離反映了pI的差異;垂直分離反映了分子量的差異。因此,原始的蛋白質組成在兩個維度上擴散。使用雙向電泳技術可以分解數千種細胞蛋白質。可以從凝膠中切取出單個蛋白質點,並通過質譜進行鑑定。
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雙向電泳研究方向
樣品製備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效,目標是儘可能擴大其溶解度和解聚,以提高分辨率。用化學法和機械裂解法破碎以儘可能溶解和解聚蛋白,兩者聯合有協同作用。對IEF(isoelectric focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用,併除去如核酸等非蛋白物質。理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理。而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換。三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP)取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵,增強了蛋白的溶解度,並導致轉至第二向的增加。兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度,作為互補試劑會更有效。在保持樣品的完整性的前提下,可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA)。除此之外,機械力被用來對蛋白分子解聚,如超聲破碎等。另外,添加PMSF等蛋白酶抑制劑,可保持蛋白完整性。由於商品化的IPG膠條是乾燥脱水的,可在其水化的過程中加樣,覆蓋整個IPG膠,避免在樣品杯中的沉澱所致的樣品丟失。此外,低丰度蛋白(low abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能,代表蛋白質組研究的“冰山之尖”,故分離低丰度蛋白是一種挑戰。亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1~15 mg級的標準)、應用敏感性檢測,可以提高其敏感性。如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測。提高組蛋白和核糖體蛋白等鹼性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點。由於鹼性pH範圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生,對PI(等電點)超過10的鹼性蛋白,通過產生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之。亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性。
雙向電泳挑戰
2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重複性。高分辨率確保蛋白最大程度的分離,高重複性允許進行凝膠間配比(match)。對2-DE而言,有3種方法分離蛋白:(1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技術為基礎。第一向應用載體兩性電解質(carrier ampholyte,CA),在管膠內建立pH梯度。隨着聚焦時間的延長,pH梯度不穩,易產生陽極漂移。(2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用於分離鹼性蛋白(pH>7.0)。如果聚焦達到平衡狀態,鹼性蛋白會離開凝膠基質而丟失。因此,在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成,但很難控制。(3)IPG-DALT發展於80年代早期。由於固相pH梯度(Immobilized pH gradient,IPG)的出現解決了pH梯度不穩的問題。IPG通過immobiline共價偶聯於丙烯酰胺產生固定的pH梯度,克服了IEF的缺點,從而達到高度的重複性。可以精確製作線性、漸進性和S型曲線,範圍或寬或窄的pH梯度。新的酸性pH 3~5或鹼性pH 6~11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4~7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊羣(proteomic contigs)從而有效分離。
雙向電泳斑點檢測
分離後的斑點檢測(spot detection)亦很重要。所採用的檢測策略和分離後所採用的方法的相互作用是很重要的。此外,還需考慮反應的線性、飽和閾/動態範圍、敏感性、對細胞蛋白羣的全體定量分析的適應性、可行性。沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離後分析技術。銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法,可檢測少到2~5ng的蛋白,因此較考馬斯亮藍R-250敏感。多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色,一些有機染料不適於PVDF膜。放射性標記不依賴其代謝的活性,並僅適於對合成的蛋白質檢測。另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳),即應用兩種不同的染料熒光標記兩個樣品,使在同一凝膠上電泳後的凝膠圖象為兩個,避免了幾種2-DE的比較,可在納克級進行檢測。
雙向電泳常見問題
重泡脹後的膠可以不用轉移到另一個電泳槽,直接跑 2D 的一向嗎?
一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時,可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收,這樣跑完 1D 和 2D 膠後,會有很多橫向條紋。所以在這種情況下,最好在重泡脹後,將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。
通常情況下,等點聚焦中體系內除了蛋白質還會存在少量帶電小分子,當這些帶電小分子在電場中向兩極運動時,會帶動膠條中的水分子運動,水分子運動會帶動附近的覆蓋油移動,當樣品質量不高,帶電小分子較多時,會導致覆蓋油移動嚴重溢出膠條槽,此時,通常會伴隨膠條的酸性端膠條厚度增加。當發生覆蓋油溢出或膠條暴露時,應及時補加覆蓋油。為了防止這個現象的發生,應從樣品製備時嚴格控制樣品質量,儘量減少帶電小分子如鹽離子的含量。同時可以在相鄰的空電泳槽裏,也加入適量(80 %滿)的覆蓋油。
跑第一向時,為什麼要設定一個電流的最大值電壓(50 μ A/ 膠)?
跑第一向時,為什麼剛開始的電壓比較低,而後逐漸增高?
剛開始時,體系內的帶電小分子比較多(比如無機鹽和雙極性分子)。所以在這個階段,電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由於這些分子質量小,移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時(無機鹽移動到極性相反的電極;兩性分子移動到對應的 pH 條帶),體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務,逐漸向所對應的 pH 區域移動,而蛋白質運動需要較高的電壓。
跑第一向時,為什麼會產生一條藍色的條帶,並逐漸向酸性端移動?
跑第一向時,為什麼電壓總達不到預定值?
當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時,聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。
跑第一向時,在電壓達到預定值後,電流為什麼會降低?
當上樣量比較少時,所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區域值,從而變成中性分子。這樣,體系的電阻越來越大,在恆定的電壓下,電流就會越來越小。
跑第一向時,為什麼在兩個電極絲附近有氣泡產生?
等電聚焦完成後,所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區域,而成為中性分子。這時加在體系上的電壓就開始電解水分子,在陽極產生氧氣,在陰極產生氫氣。
硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性,特別是鹼性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值後,就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集,從而降低其在隨後的二向膠時的遷移效率,可能會造成豎的脱尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑑定中性蛋白質之間的相互作用,防止它們的聚集。
怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值?
可以根據膠條的pH範圍和長度估算蛋白質點的pI值,在第二向中加入分子量Marker估算蛋白質點分子量。也可以用體系內已知蛋白來做比對。
為什麼 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脱尾?
什麼成分會影響 2D 膠的效果?
核酸,鹽,去垢劑等等。
2D 膠的上樣量應該在什麼範圍?
上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些,這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系,上樣量大概在 100 微克(銀染)到 500 微克(考染)之間。
我的蛋白質濃度很低,應該用什麼方法來濃縮?
蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法,沉澱法和透析法。超濾比較温和,對蛋白質不會有修飾和改變,蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少(被膜所吸附)。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油,去垢劑都會堵塞濾膜,影響超濾的效果。沉澱法比較快速,容易操作,對鹽,甘油,去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉澱下來(丟失)。沉澱法中,又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時,一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉澱兩次,去處殘留的 TCA 和其他沉澱下來的雜質。透析法只使用於量比較大的樣品,量小時,操作困難。透析法可以和超濾法聯用。先把樣品透析到一個比較乾淨的環境(不含鹽,甘油,去垢劑或其它雜質,比如碳酸氫氨溶液),然後再進行超濾。
雙向電泳操作步驟
第一向等電聚焦
⒉ 在小管中加入0.01g DTT, 0.5% 對應膠條pH範圍的IPG buffer,充分混勻。
⒋ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預製膠條,室温中放置10分鐘。
⒌ 沿着聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣,中間的樣品液一定要連貫。注意:不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分佈。
⒎ 分清膠條的正負極,輕輕地將IPG膠條膠面朝下置於聚焦盤或水化盤中樣品溶液上,使得膠條的正極(標有+)對應於聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上,因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡,用鑷子輕輕地提起膠條的一端,上下移動膠條,直到氣泡被趕到膠條以外。
⒏ 在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油,防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油,沿着膠條,使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
⒐ 對好正、負極,蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
⒑聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳,否則將膠條置於樣品水化盤中,-20℃冰箱保存。
第二向SDS-PAGE電泳
⒈ 裝配灌膠模具,配製10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配200ml凝膠溶液,每塊凝膠50ml,將溶液沿灌膠模具背面槽道倒入,直至溶液到距離玻璃板1cm停止,用75%乙醇或水飽和正丁醇封面,保持膠面平整。聚合30分鐘後,凝膠與上方液體分層,表明凝膠已基本聚合,建議聚合3-5h使凝膠完全聚合。
⒊ 從-20℃冰箱中取出的膠條,先於室温放置10分鐘,使其恢復至室温。
⒋ 配製膠條平衡緩衝液I(含DTT)。
5.在桌上先放置乾的厚濾紙,聚焦好的膠條膠面朝上放在乾的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕,擠去多餘水分,然後直接置於膠條上,輕輕吸乾膠條上的礦物油及多餘樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。
⒍ 將膠條轉移至平衡管或溶脹盤中,每個槽一根膠條,在有膠條的槽中加入5-10ml膠條平衡緩衝液I。將平衡管或溶脹盤放在水平搖牀上緩慢搖晃15分鐘。
⒎ 配製膠條平衡緩衝液Ⅱ(含碘乙酰胺)。
⒏ 第一次平衡結束後,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液I。並用濾紙吸取多餘的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。再加入膠條平衡緩衝液Ⅱ,繼續在水平搖牀上緩慢搖晃15分鐘。
⒐ 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多餘的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上,長玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝膠的頂部對着自己。
⒑將低熔點瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
⒓第二次平衡結束後,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液Ⅱ。並用濾紙吸取多餘的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。
⒔將IPG膠條從樣品水化盤中移出,用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸沒在1×電泳緩衝液中。然後將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其餘膠條同樣操作。
⒕將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上,短玻璃板一面對着自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
⒗放置5分鐘,使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
⒘在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固後。將凝膠轉移至電泳槽中。
⒙在電泳槽加入電泳緩衝液後,接通電源,起始時用的低功率(1W/gel/18-24cm)或低電壓,待樣品在完全走出IPG膠條,濃縮成一條線後,再加大電流(或電壓)(13-15W/gel/18-24cm),待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
⒚電泳結束後,輕輕撬開兩層玻璃,取出凝膠,並切角以作記號(戴手套,防止污染膠面)。
⒛進行染色。
雙向電泳送樣要求
1、 樣品新鮮。
2、 樣品蛋白的總量不少於1mg。
説明:組織樣本每份約250-500mg;
細胞樣品每份106—107細胞數(一塊膠);
血液、血清等樣品大於5mL,且不能溶血;
蛋白提取物要求蛋白濃度大於5mg/mL,總量不少於1mg,且均勻無沉澱,樣品中無鹽成分;
植物或真菌樣品量濕重不少於2g;
富含雜質或蛋白質含量低的樣品量濕重不少於3g
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- 參考資料
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- 1. 蛋白質雙向凝膠電泳 .蛋白質雙向凝膠電泳[引用日期2013-09-19]
- 2. David L. Nelson & Michael M. Cox.Lehninger Principles of Biochemistry SEVENTH EDITION.:W. H. Freeman and Company,2017.