差異基因

中文名字：差異基因

英文名字：Differential Gene

定義1：是指一個基因在RNA水平處在不同環境壓力、時間、空間等方面下，表達有顯著性差異的基因。

應用學科：生物化學與分子生物學（一級學科），核酸與基因（二級學科）

定義2：在不同因素下基因突變或者甲基化等結構發生改變導致差異的基因。

應用學科：生物化學與分子生物學（一級學科），核酸與基因（二級學科）

人體基因組圖譜好比是一張能説明構成每個人體細胞脱氧核糖核酸（DNA）的30億個鹼基對精確排列的“地圖”。科學家們認為，通過對每一個基因在疾病中差異表達的測定，人們將能夠找到新的方法來治療和預防許多疾病，如癌症和心臟病等。該圖非常形象地把基因家族的基因片段描繪出來。

Science和Nature等各大雜誌上近幾年也一直有刊登通過差異基因對生活、健康、疾病等進行研究的報道，專家學者通過差異基因來作為早期疾病的診斷標誌物為人類醫療行業的進步做着不斷的努力。

從PCR到新一代高通量測序，隨着實驗技術的不斷進步，差異基因開始被越來越多的研究者所關注，醫生不再停留在表型和蛋白層面，而是追溯他們的上游對核酸進行挖掘。

常用的技術有DD-PCR、GENE-FISHING、GENE CHIP、高通量測序等，簡單介紹如下：

DDRT-PCR技術即mRNA差異顯示聚合酶鏈式反應技術，此技術是以PCR技術和聚丙烯凝膠電泳技術為基礎，結合銀染或放射性自顯影等顯色技術，能快速有效地鑑定並克隆兩個或多個平行材料之間的差異表達基因。DDRT-PCR技術的基本過程如下：

①提取兩組平行材料中的總RNA或mRNA

②在逆轉錄酶作用下，以Oligo dT12MN為錨定引物將mRNA反轉錄成cDNA

③ 以cDNA為模板利用10一mer隨機引物和錨定引物進行PCR擴增

④ 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，結合銀染等顯色方法獲得平行材料間的差異cDNA片段，回收並再擴增差異片段

⑤Northern blotting檢測差異cDNA片段是否為陽性片段

⑥克隆cDNA片段並測序

⑦ 根據測序結果篩選cDNA文庫或使用RACE技術獲得cDNA片段側翼序列，進而獲得其全長cDNA基因。

GeneFishing技術用來檢測不同樣品間的表達差異。該技術着眼於解決用來檢測基因表達差異的方法所面臨的問題，如芯片技術和差異顯示技術。該技術的實驗包括以下三個步驟，反轉錄PCR (RT) 和兩步法PCR (GeneFishing PCR)。

第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一鏈。dT-ACP1引物的3′端與mRNA的多聚A互補。這樣第一鏈cDNA包含了dT-ACP1引物 5´端的通用序列。

第二步: 把第一步得到的第一鏈cDNA稀釋後和隨機ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。隨機ACP引物的3′端序列能有效的結合到第一鏈cDNA的某一部位。在第一步PCR時，通過控制條件只能使隨機ACP的3′端特異的結合到第一鏈cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火結合到第一鏈cDNA。通過第一步PCR合成第二鏈cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互補序列，而其5′端包含了隨機ACP的通用序列。

第三步: 來自第二步的PCR管的混合物在更嚴格條件下進行第二步PCR，這時使dT-ACP2和隨機ACP能各自退火結合到第二步得到雙鏈cDNA的3′ 端和5′端。既然第二鏈cDNA的3′端序列與隨機ACP引物的通用序列互補，而其5′端與dT-ACP2的通用序列互補，這樣保證了只擴增目標產物。

該技術特點如下：

(1) 無假陽性。GeneFishing技術鑑別的差異表達基因均可通過Northern Blot分析或RT-PCR證實！現有的DEG檢測方法，例如生物芯片和差異顯示技術的主要瓶頸就是假陽性的存在。無假陽性可以使研究者能快速辨別可信的差異表達基因。

(2) 無需PAGE（聚丙烯酰胺凝膠），瓊脂凝膠法即足夠。退火控制引物(ACP)極大地提高了PCR擴增的特異度和靈敏度，從而產生特異PCR產物。而且，GeneFishing 技術只需要少量的起始物質。PCR產物可以在標準的溴化乙啶染色的瓊脂凝膠中被檢測，因而省去了使用PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）的繁瑣處理步驟。使用GeneFishing 技術在瓊脂凝膠中產生的條帶具有足夠濃度，可以被Northern Blot方法檢測。

(3) 無需昂貴的檢測方法。放射性/熒光檢測方法由於其成本和危險性而不能廣泛應用。昂貴的檢測方法是現今差別表達基因檢測的另一缺點。因此，可以使用標準溴化乙啶染色的瓊脂凝膠來進行檢測是GeneFishing 技術的一個主要優勢。

(4) 重複性保證。GeneFishing技術的所需反應試劑均由試劑盒提供。這樣防止了由於使用舊的，不匹配的試劑而帶來的變化，確保了可靠的重複性。

(5) 無需特殊技術。GeneFishing 技術是一種以PCR技術為基礎的創新方法，簡單易用。

(6) 快速經濟。GeneFishing技術使得研究者可以在5小時內確認有效的差異表達基因，不必因為假陽性而浪費時間。相比之下，所有其他DEG篩選方法都需要大量的後續工作和時間來鑑別有效的差異表達基因。

(7) 大範圍的PCR產物。每一個GeneFishing PCR反應產生從150bp至2kb長度範圍的PCR產物，這不僅提高了鑑別差異表達基因的機會，還為預測基因功能提供了更多的有效序列信息。

基因芯片技術的原理類似我們日常所説的計算機芯片，只是在固體基質上的不是集成着各種半導體管，而是成千上萬的基因探針，待分析的樣品通過和芯片中已知序列的DNA片段鹼基互補雜交，經過計算機的分析，從而確定待測核酸序列和性質，表現出基因表達量和一些序列本身的特性。該技術主要包括四個環節：芯片微列陣製備，樣品製備，生物分子反應和信號的檢測分析。製備方法主要是採用表面化學的方法或是組合化學的方法來處理固相基質，如玻璃片或硅片。在固體材料中刻出微濾柵、微通道，並加上微泵、微閥來控制流體。然後將探針以預先設計的順序固定在固體基質上。微列陣製備技術主要有兩種基本方法：原位合成法和點樣法。

測序技術推進科學研究的發展。隨着第二代測序技術的迅猛發展，科學界也開始越來越多地應用第二代測序技術來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行重頭測序（de novo sequencing），獲得該物種的參考序列，為後續研究和分子育種奠定基礎；對有參考序列的物種，進行全基因組重測序（resequencing），在全基因組水平上掃描並檢測突變位點，發現個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上進行全轉錄組測序（whole transcriptome resequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態性（cSNP）等研究；或者進行小分子RNA測序（small RNA sequencing），通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發現新的microRNA分子。在轉錄組水平上，與染色質免疫共沉澱（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉澱（MeDIP）技術相結合，從而檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區域和基因組上的甲基化位點。

全轉錄組研究是一種被廣泛應用的、從整體的層次研究材料中基因表達與調控的研究手段，在探索生命過程以及形形色色的生物學問題，如疾病發生等的研究中發揮重要的作用。以前的轉錄組研究主要側重於對mRNA的研究，隨着不同類型RNA分子的發現以及其重要生物學功能的揭示，轉錄組的研究內容也隨之拓展。新一代測序技術以其高通量數據的產出為鑑定低丰度表達的轉錄本提供了機會，另一方面，文庫構建技術的發展也使科研人員有機會更高效全面的捕獲RNA分子。人們將有機會更全面深入地認識轉錄組，並在此基礎上開展研究。

對一個病人的全基因組測序來發現他或她的疾病的起源還是不能作為常規的。但是，遺傳學家正在努力靠近。發表在雜誌American Journal of Human Genetics上的一份病例報告表明研究人員能將簡單血液測試與基因組專業概要掃描相結合來診斷嚴重代謝性疾病。埃默裏大學醫學院和桑福德-伯納姆醫學研究所的研究人員使用全外顯子組測序法在2004年出生的男孩身上來尋找導致糖基化作用紊亂的突變。負責這個男孩疾病的基因稱DDOST，此基因的突變以前在其他糖基化作用紊亂病例中還沒有被觀察過。全外顯子組測序法是讀取部分基因組的一種更便宜、更快速但有效的策略，其中部分基因組是科學家們所相信的診斷疾病的最重要的。報告舉例説明了全外顯子組測序法正在進入醫療實踐，這種測序法是在2011年首次被商業化地提供給臨牀診斷。埃默裏大學遺傳學實驗室正準備開始將全外顯子組測序法作為臨牀診斷服務進行提供。據估計，許多致病性突變（約85%）在編碼蛋白的基因組區域內發現，那是細胞的工作機制。全外顯子組測序法只讀取人類基因組中編碼蛋白的部分，剩下基因組餘下的99%不讀取。

以往對差異基因的研究停留在mRNA（信使RNA）和基因變異的層面上。近日，美日三個研究小組2012年2月12日在美國《自然—醫學》Nature Medicine雜誌同時發文，宣佈已發現會引發肺腺癌的異常基因。據悉，在甲狀腺癌等的治療藥物中，有些有望對該基因誘發的癌變具有抑制作用。

該異常基因名為“KIF5B-RET融合基因”，是由兩個基因在某種原因下融合形成的。發表此結果的三個研究小組分別為：日本癌症研究會和自治醫科大學小組、日本國立癌症研究中心小組、美國的研究所及名古屋市立大學小組。

有分析認為，肺腺癌佔肺癌總數的約7成。各小組對患者組織進行調查時，在1~2%的患者體內發現了該融合基因。通過白鼠細胞等試驗，各小組發現了這種融合基因具有誘發癌症的特性，並確認甲狀腺癌等的治療藥等可殺死由此產生的癌變細胞。像這種新的融合基因表達引起的疾病會給我們在將來的疾病治療中帶來新的視角。

在芯片方向主要代表為Affymetrix ,Aglient, illumina等公司。在2011年底Affymetrix推出了Glue Grant Human Transcriptome Array，這種芯片將複雜的轉錄組信息合成在一張芯片上，能對mRNA，lncRNA，microRNA進行差異篩選，並且還能檢測他們之中的SNP位點，可謂是芯片技術的一大革新。

在測序方向需要特別指出的是第二代測序結合微陣列技術而衍生出來的應用--目標序列捕獲測序技術（Targeted Resequencing）。這項技術首先利用微陣列技術合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區域互補結合，從而富集到特定區段，然後用第二代測序技術對這些區段進行測序。提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen ，應用最多的是人全外顯子組捕獲測序。科學家們認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優勢，不僅僅是費用較低，更是因為外顯子組測序的數據分析計算量較小，與生物學表型結合更為直接。

前不久剛剛結束的Science雜誌年度十大科學突破評選中，外顯子組測序名列其中。