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高通量測序

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高通量測序技術(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(Next-generation sequencing technology),或大規模平行測序(Massively parallel sequencing,MPS)。區別於傳統Sanger(雙脱氧法)測序,能夠一次並行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術,通常一次測序反應能產出不低於100Mb的測序數據。 [2] 
中文名
高通量測序
外文名
High-throughput sequencing
又    稱
“下一代”測序技術
公    司
Life Sciences公司

高通量測序簡介

測序法已經成為一種常規的實驗技術,不過最近新一代測序技術的顯著優勢,比如大規模平行信號(MPSS, Brenner et al.2000)和焦磷酸測序法(也稱454測序; Margulies et al.2005, Langaee and ronaghi2005)已經使測序技術發生了徹底的變革,它們可以同時對數百萬個短序列讀長進行測序。
Sanger 等在20 世紀70 年代中期發明了DNA 末端終止法測序技術,他的發明第一次為人們開啓瞭解讀生命遺傳密碼的大門。此後測序法已經成為一種常規的實驗技術,大規模平行測序的出現更是使測序技術發生了徹底的變革, 它們可以同時對數百萬個短序列讀長進行測序,從大規模平行信號測序(MPSS, Brenner et al.2000),到454焦磷酸測序法( Margulies et al.2005),illumina邊合成邊測序(sequencing by synthesis,SBS),SOLiD連接法測序,Ion Torrent利用離子敏感場效應晶體管檢測pH值變化的合成測序法,華大智造聯合探針錨定合成測序法(combinatorial probe-anchor synthesis,cPAS),大規模平行測序出現百花齊放的技術演化,使得科研人員能夠以相對較少的經費獲得海量DNA 序列。 [2]  儘管面臨着來自生物信息學方面的挑戰,但是這些技術為探索更多生態學與進化問題提供了更多的機會,其中包括對生物多樣性的分析( Venter etal.2004)。此外,二代測序技術是最不可能由於操作不當、缺失、稀有轉錄及克隆細菌不穩定的原因而產生錯誤的。技術進步使得這一方法變得不斷可靠( Hamady et al.2008),絕大多數的轉錄表達(包括那些表達量極少的轉錄本)都能夠被精準地定量( StoloⅦ itzky etal.2005)。 [1]  隨着序列讀長的增加,大規模平行測序將被廣泛應用於全基因組測序,全外顯子測序,目標基因測序,轉錄組測序,甲基化測序等應用。 [2] 

高通量測序名詞解釋

根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等,主要有以下幾種:大規模平行簽名測序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸測序(454 pyrosequencing)、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序(Ion semiconductor sequencing)、DNA 納米球測序 (DNA nanoball sequencing)、聯合探針錨定合成測序法(combinatorial probe-anchor synthesis,cPAS)等。 [2] 
高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變,一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定,因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing)足見其劃時代的改變,同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細緻全貌的分析成為可能,所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。

高通量測序實驗過程

1.樣本準備(sample fragmentation)
2.文庫構建(library preparation)
3.測序反應(sequencing reaction)
4.數據分析(data analysis)

高通量測序測序平台

自從2005年454 Life Sciences公司(2007年該公司被Roche正式收購)推出了454 FLX焦磷酸測序平台(454 FLX pyrosequencing platform)以來,曾推出過3730xl DNA測序儀(3730xl DNA Analyzer)的Applied BioSystem(ABI)這家一直佔據着測序市場最大份額的公司的領先地位就開始動搖了,因為他們的拳頭產品毛細管陣列電泳測序儀系列(series capillary array electrophoresis sequencing machines)遇到了兩個強有力的競爭對手,一個就是羅氏公司(Roche)的454 測序儀(Roch GS FLX sequencer),另一個就是2006年美國Illumina公司推出的Solexa基因組分析平台(Genome Analyzer platform),為此,2007年ABI公司推出了自主研發的SOLiD 測序儀(ABI SOLiD sequencer)。2010年Ion torrent公司(被ThermoFisher收購)推出了Ion PGM,2015年華大智造推出了BGISEQ-500測序平台,這5家公司構成了市面上主要的高通量基因測序儀制造商,並不斷進行儀器的升級,推出新的測序機型。不過只有illumina,華大智造和ThermoFisher這三家的測序儀中部分機型進入了IVD市場(NMPA獲批),其他公司設備主要應用在基礎科研、公共衞生、分子育種、法庭科學等領域。表一列出了主流的高通量測序儀及相關參數: [2] 
表一:主流測序平台一覽
公司
測序化學
擴增方法
機型
最大reads數/run
最大通量(Gb)
讀長
測序時間(小時)
主要應用
llumina
因美納
邊合成邊測序
橋式PCR
Iseq 100
4M
0.144-0.3
36-75bp SE
9-10
小基因組測序,目標基因測序,擴增子測序
8M
0.6-1.2
75-150bp PE
13-17.5
MiniSeq
25M
1.65-1.875
75bp SE
7
小基因組測序,目標基因測序,目標基因表達譜,16S宏基因組測序
50M
3.3-3.75
75bp PE
13
6.6-7.5
150bp PE
24
MiSeq
25M
3.3-3.8
75bp PE
21
小基因組測序,目標基因測序,16S宏基因組測序
50M
13.2-15
300bp PE
56
Nextseq550
0.4B
25-30
75bp PE
11
小基因組測序,目標基因測序,16S宏基因組測序mRNA-seq,small RNA-seq
0.8B
50-120
75-150bp PE
18-29
HiSeq 3000
2.5B
105-125
50bp PE
24-84
外顯子測序,全轉錄組測序
5B
325-750
75-150bp PE
HiSeq 4000
5B
210-250
50bp PE
24-84
外顯子測序,全轉錄組測序
10B
650-1500
75-150bp PE
HiSeqX
6B
1600-1800
150bp PE
72
全基因組測序
NovaSeq 6000
2.6-3.2B
134-500
50bp PE
13-16
全基因組測序,外顯子測序,全轉錄組測序,甲基化測序
6.6-8.2B
333-1250
100bp PE
19-36
16-20B
1600-3000
150bp PE
25-44
ThermoFisher Scientific賽默飛世爾科技(Ion Torrent)
邊合成邊測序
乳液PCR
Ion 510 Chip
2-3M
0.3-1
200-400bp
2.5-4
目標區域測序,外顯子測序,轉錄組測序,小基因組測序
Ion 520 Chip
4-6M
0.6-2
200-400bp
3-4M
0.5-1.5
600bp
Ion 530 Chip
15-20M
3-8
200-400bp
9-20M
1.5-4.5
600bp
Ion 540 Chip
60-80M
10-15
200bp
Ion 550 Chip
100-130M
20-25
200bp
MGI華大智造
聯合探針錨定合成測序
滾環擴增
MGISEQ-200
300M
60
50-100bp SE/PE
48
小基因組,目標區域測序
BGISEQ-500
1300M
520
50-100bp SE/PE
45-213
全基因組,全外顯子,目標區域測序,RNAseq
MGISEQ-2000
1800M
1080
50-100bp SE/PE
150-300bp PE
48
全基因組,全外顯子,轉錄組測序
DNBSEQ-T7
-
6000
100-150bp PE
24
全基因組,深度外顯子測序,轉錄組測序,目標panel測序 [3] 
Illumina Solexa 合成測序
(sequence by synthesis)
Illumina Genome AnalyzerIIx測序原理
Illumina公司的新一代測序儀Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高準確性,高通量,高靈敏度,和低運行成本等突出優勢,可以同時完成傳統基因組學研究(測序和註釋)以及功能基因組學基因表達及調控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究。Hiseq是一種基於單分子簇的邊合成邊測序技術,基於專有的可逆終止化學反應原理。測序時將基因組DNA的隨機片段附着到光學透明的玻璃表面(即Flow cell),這些DNA片段經過延伸和橋式擴增後,在Flow cell上形成了數以億計Cluster,每個Cluster是具有數千份相同模板的單分子簇。然後利用帶熒光基團的四種特殊脱氧核糖核苷酸,通過可逆性終止的SBS(邊合成邊測序)技術對待測的模板DNA進行測序。
ThermoFisher Scientific半導體芯片測序
賽默飛的Ion Torrent平台採用乳液PCR法擴增連接在磁珠上的單個DNA分子,接下來磁珠結合到一個半導體芯片上,芯片包含一個獨立的pH感應器晶體管,當磁珠上的DNA分子進行合成測序時,pH發生改變,晶體管通過pH的變化從而獲得DNA序列信息。 [2] 
MGI華大智造cPAS測序
(combinatorial probe-anchor synthesis)
MGI的DNBSEQ/MGISEQ系列測序儀,通過滾環複製將一個單鏈DNA環狀分子擴增成DNA納米球(DNA nanoballs,DNB)[14],再將DNB加載到芯片上。在DNB進行合成測序時,結合的核苷酸釋放出的熒光被採集,從而讀出DNA序列信息。這些測序儀已經被廣泛用於臨牀樣本的傳染病測序。 [2] 
Roche 454焦磷酸測序
(pyrophosphate sequencing)
該技術將固化引物的微球與單鏈DNA 相結合,構建DNA 模板文庫,利用微乳滴PCR 來生成擴增產物。經過多輪循環,每個微球表面都結合了大量相同的DNA 片段。富集微球並轉移到帶有規則微孔陣列的微孔板上,每個微孔只能容納1 個微球。微孔板的其中一面可以進行測序反應,另一面則與CCD 光學檢測系統相接觸。序列測定同樣採用邊合成邊測序。三磷酸核苷結合到DNA 鏈上會釋放出焦磷酸,此時通過熒光素酶和ATP 硫酰化酶產生級聯反應會釋放出光信號,利用該光學信號來進行檢測DNA序列。 [2] 
ABI SOLiD連接法測序
(sequence by ligation)
與454 類似,SOLiD 也採用微乳滴PCR 的方法擴增DNA 模板,並將擴增微球固定在玻璃基板上形成高通量的陣列。SOLiD 採用連接反應進行邊合成邊測序。將通用引物與連在微球上的DNA 文庫模板雜交,然後進行一系列的連接反應。每個連接反應都發生在DNA 延伸鏈和帶有熒光標記的單鏈八核苷酸探針池中的某一探針之間。八核苷酸探針的鹼基與特定的熒光顏色有明確的對應關係。經過一系列複雜的連接,酶切和下一引物結合的反應循環後,獲取熒光圖象,即可根據鹼基與熒光之間的對應關係讀出DNA 序列信息。 [2] 

高通量測序技術應用

測序技術推進科學研究的發展。隨着第二代測序技術的迅猛發展,科學界也開始越來越多地應用第二代測序技術來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行從頭測序(de novo sequencing),獲得該物種的參考序列,為後續研究和分子育種奠定基礎;對有參考序列的物種,進行全基因組重測序(resequencing),在全基因組水平上掃描並檢測突變位點,發現個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上進行全轉錄組測序(whole transcriptome resequencing),從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)等研究;或者進行小分子RNA測序(small RNA sequencing),通過分離特定大小的RNA分子進行測序,從而發現新的microRNA分子。在轉錄組水平上,與染色質免疫共沉澱(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉澱(MeDIP)技術相結合,從而檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區域和基因組上的甲基化位點。
這邊需要特別指出的是第二代測序結合微陣列技術而衍生出來的應用--目標序列捕獲測序技術(Targeted Resequencing)。這項技術首先利用微陣列技術合成大量寡核苷酸探針,這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區域互補結合,從而富集到特定區段,然後用第二代測序技術對這些區段進行測序。提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen ,應用最多的是人全外顯子組捕獲測序。科學家們認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優勢,不僅僅是費用較低,更是因為外顯子組測序的數據分析計算量較小,與生物學表型結合更為直接。
高通量測序開始廣泛應用於尋找疾病的候選基因上。內梅亨大學的研究人員使用這種方法鑑定出Schinzel-Giedion 綜合徵中的致病突變,Schinzel-Giedion綜合徵是一種導致嚴重的智力缺陷、腫瘤高發以及多種先天性畸形的罕見病。他們使用Agilent SureSelect序列捕獲和SOLiD對四位患者的外顯子組進行測序,平均覆蓋度為43倍,讀長為50 nt,每個個體產生了2.7-3 GB可作圖的序列數據。他們聚焦於全部四位患者都攜帶變異體的12個基因,最終將候選基因縮小至1個。而貝勒醫學院基因組測序中心也計劃對15種以Science雜誌年度十大科學突破上疾病進行研究,包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉症以及其他遺傳疾病,以更好地理解致病突變以及突變對疾病的影響。前不久剛剛結束的評選中,外顯子組測序名列其中。
以上我們盤點了2010年第二代測序技術的最新進展和相關應用。但是除了第二代測序之外,還有另外一種以單分子實時測序和納米孔為標誌的第三代測序技術也正在如火如荼的發展中,只是應用範圍還沒有二代測序廣泛。 [2]  所以科學界所説的高通量測序還指的是第二代測序。

高通量測序意義

高通量測序技術的誕生可以説是基因組學研究領域一個具有里程碑意義的事件。該技術使得核酸測序的單鹼基成本與第一代測序技術相比急劇下降, 以人類基因組測序為例, 上世紀末進行的人類基因組計劃花費 30 億美元解碼了人類生命密碼, 而第二代測序使得人類基因組測序已進入萬(美)元基因組時代。如此低廉的單鹼基測序成本使得我們可以實施更多物種的基因組計劃從而解密更多生物物種的基因組遺傳密碼。同時在已完成基因組序列測定的物種中, 對該物種的其他品種進行大規模地全基因組重測序也成為了可能。
參考資料