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dna提取
鎖定
- 中文名
- dna提取
- 主要方法
- CTAB方法
- 物理方式
- 玻璃珠法、超聲波法等
- 化學方式
- 異硫氰酸胍法、鹼裂解法等
dna提取主要分類
雙鏈環狀、雙鏈線性、單鏈環狀
dna提取提取原則
1.保證核酸一級結構的完整性;
4.其他核酸分子,如RNA,也應儘量去除。
dna提取樣品準備
dna提取生物組織
一.最好新鮮組織,若不能馬上提取,應貯存-70℃或液氮
二.液氮冷凍敲碎研磨
三.組織勻漿法
四.液氮勻漿法
dna提取培養細胞
懸浮生長細胞:1500g離心,4℃10分種收集細胞
單層培養細胞:可用刮棒或胰酶消化後離心收集
dna提取血液樣品
dna提取提取方法
二.甲酰胺解聚法:破碎細胞同上,然後用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合,再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。
五.表面活性劑快速製備法:用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞,然後用蛋白酶K或酚去除蛋白,乙醇沉澱或透析。
七.鹼變性快速製備:先用NaOH作用20分鐘,再加HCI中和,離心後取上清,含少量DNA。
dna提取濃縮
三.乙醇或異丙醇沉澱:(1)需要陽離子鹽的存在,NaAc最常用,NaCl對含SDS樣品好,NH4Ac去除dNTP好。PiCl沉澱RNA好,但不能用於反轉錄前。(2)沉澱温度與時間;0℃一4℃,12000g,10分鐘,小於100bp DNA需超速離心。
dna提取鑑定
凝膠電泳分析
影響瓊脂糖凝膠電泳DNA遷移率的因素:①DNA分子大小,DNA分子越大遷移速度越慢。②遷移率與瓊脂糖濃度成反比。③DNA構象:a.相同分子量的超螺旋環狀(Ⅰ型),切口環狀(Ⅱ型),線狀(Ⅲ型)DNA,以不同速率通過凝膠。b.一般情況下,遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④電壓:遷移率與所加電壓成正比,但是電壓過大有效分離範圍減小。⑤電場方向:單一方向速率均等,改變方向,極大分子DNA遷移更慢。通過脈衝電場凝膠電泳分離極大DNA。
dna提取檢測
dna提取溴乙錠染色
dna提取銀染法
Ag+與DNA形成複合物,在甲醛還原下可染成黑褐色,靈敏度高200倍,但不能回收。
dna提取簡單分析
通常與已知分子量的標準DNA片段一起電泳,經比較可獲知DNA標本大小。如條帶拖尾,系加入DNA量太多或凝膠未制好。若DNA分子量小或一片模糊,表明DNA有降解。
dna提取回收
電泳到DEAE-纖維素膜
在所需條帶前插入DEAE-纖維素膜,繼續電泳至條帶DNA都到膜上,取出洗下。
低熔點瓊脂糖凝膠
切下膠,加熱熔化膠,然後用酚抽提回收DNA。
dna提取定量
dna提取分光光度法
dna提取瓊脂糖平板法
dna提取微型凝膠電泳
dna提取貯存
dna提取短期儲存
4℃或-20℃存放於TE緩衝液中。