蛋白質測序

當前，所謂蛋白質測序，主要指的是蛋白質的一級結構的測定。蛋白質的一級結構(Primary structure)包括組成蛋白質的多肽鏈數目。很多場合多肽和蛋白質可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。

蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現在已經知道約十萬個不同蛋白質的一級結構。

●1 樣品必需純（>97%以上）；

●2 知道蛋白質的分子量；

●3 知道蛋白質由幾個亞基組成；

●4 測定蛋白質的氨基酸組成；並根據分子量計算每種氨基酸的個數。

●5 測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。

●1肽鏈的拆開和分離

●2測定蛋白質分子中多肽鏈的數目

●3二硫鍵的斷裂

●4測定每條多肽鏈的氨基酸組成，並計算出氨基酸成分的分子比

●5N端、C端的測定

●6多肽鏈斷裂

●7測定每個肽段的氨基酸順序。

●8確定肽段在多肽鏈中的次序。

●9確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。

●常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應時間約20小時。

●此法的優點是不容易引起水解產物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；

●含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬(天冬)酰胺和谷氨醯胺側鏈的酰胺基被水解成了羧基。

●一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。

●由於水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產率不高。部分的水解產物發生消旋化。

●該法的優點是色氨酸在水解中不受破壞。

●目前用於蛋白質肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。

●應用酶水解多肽不會破壞氨基酸，也不會發生消旋化。水解的產物為較小的肽段。

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈藉助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).

2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關係，即可確定多肽鏈的數目。

3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然後用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。

二硫鍵的切割與保護（元素後數字為下標）

a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆

－CH2SO3H

b、還原+氧化 不可逆

[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等

－S-CH2-COOH

c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

－R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

巰基（-SH）的保護

作用：這些反應(見右圖1）可用於巰基的保護。

4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，並計算出氨基酸成分的分子比（如右圖1）

5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端

多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。

6 多肽鏈斷裂成多個肽段。可採用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，並將其分離開來。

7 測定每個肽段的氨基酸順序

8 確定肽段在多肽鏈中的次序。

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

一般採用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理後，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然後同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。