γ-氨基丁酸

1993年有學者第一次通過化學合成的方法成功研製出了GABA。此後的相關研究日益豐富。為了獲得更多的GABA，科研人員開始了各種嘗試，並獲得了諸多成果。 ^[2] 

比較重要的化學合成主要有以下幾種：第一種是採用鄰苯二甲酰亞氨鉀以及γ-氯丁氰或丁內酯作為製作GABA的原料，劇烈反應並水解後得到的最終產物就是GABA；第二種是利用吡咯烷酮作為最初的原料，並通過氫氧化鈣以及碳酸氫銨進行水解，最終使其開環得到的產物就是GABA；第三種是把丁酸和氨水作為GABA的原料，使其在γ射線條件下進行光照反應得到GABA；第四種是通過輝光放電的方法，用丙胺和甲酸兩種物質進行合成得到GABA；第五種是把溴乙酸甲酯和乙烯作為製備GABA的原料，通過聚合反應得到4-溴丁酸甲酯，最後經過氨解和水解後的產物即為GABA。GABA的化學合成方法都存在反應不容易控制、成本比較高的缺點。 ^[2] 

植物富集法是一種新型開發的合成萃取提純技術，它是用GABA含量較高的植物進行分離提取，這樣便有了既便宜純度又高的GABA產品。從植物中獲取GABA的方法主要有以下兩種：其中一種是利用溶劑萃取提純法，另一種是柱分離製備法。 ^[2] 

溶劑萃取法是利用水或醇作為GABA的提取劑，根據植物在水或者醇中的溶解度以及分配係數不同的原理將GABA提出到水或者醇中，並且經過反覆的過濾提純，可以使植物中絕大多數的GABA都被萃取出來。 ^[2] 

柱分離製備法，又被叫做柱色譜法，是一種利用不同的混合物中的組分在固液兩相中具有不同分配係數的原理，進行洗脱分離及其他後續操作，它的大分類應該歸屬於層析法。色譜柱一般採用樹脂、硅膠或活性炭等作為填充材料。 ^[2] 

微生物發酵法是通過選擇品種優良、穩定以及無毒無害的菌種，利用這些菌種在生長繁殖的過程中對GABA進行製備和產出。這種方法雖然對環境的要求比較苛刻，對設備的要求較高，但是此法產出的GABA可作為天然的食品添加劑。利用微生物發酵生產，是食品行業中發展最早，領域最廣泛的生產方式之一，最早利用的微生物是大腸桿菌，利用它的脱羧酶可生產GABA，但是由於其本身存在一些安全隱患，使其一直無法直接用於藥品或者食品的生產製作。 ^[2] 

隨着科學技術的發展，綠色食品越來越受到人們的重視，後來科研人員發現乳酸菌、酵母菌以及麴黴菌等微生物都可以用來代替大腸桿菌，催化生產GABA。而且在較低成本的情況下，還具有產量高、安全性好的優勢，此種方法已經逐漸在向產業化生產發展。 ^[2] 

γ－氨基丁酸別名4－氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡稱GABA），是一個氨基酸，化學式：H₂NCH₂CH₂CH₂COOH；分子質量：103.1。GABA呈白色結晶體粉末狀，沒有旋光性。 ^[2]  熔點195-204℃（分解） ^{[3]  [4]}  ，與水混溶，微溶於乙醇、丙酮，不溶於苯、乙醚，分解時會失水生成吡咯烷酮。 ^[3] 

GABA在溶液中常以兩性離子（帶負電荷的羧基和帶正電荷的氨基）形式存在，由於正負電荷基團間的靜電相互作用，使得GABA在溶液中能夠兼具氣態（摺疊態）和固態（伸展態）時的分子構象，而GABA在溶液中多分子構象共存的形式，使其能夠結合多種受體蛋白併發揮多種重要生理功能。 ^[5] 

植物組織中GABA的含量極低，通常在0.3～32.5 μmol/g之間。已有文獻報道，植物中GABA富集與植物所經歷脅迫應激反應有關，在受到缺氧、熱激、冷激、機械損傷、鹽脅迫等脅迫壓力時，會導致GABA的迅速積累。對植物性食品原料採用某種脅迫方式處理後，或通過微生物發酵作用使其體內GABA含量增加，用這種原料加工成富含GABA的功能產品已成為研究熱點。GABA作為一種新型功能性因子，已被廣泛應用於食品工業領域。利用富含GABA的發芽糙米、大豆和蠶豆等原料開發的食品已面市。 ^[1] 

歐洲食品安全局（EFSA）雖然允許食物中添加GABA，規定GABA的膳食攝入量上限為550mg/d，但是其主要功能特性尚需嚴格的人羣試驗結果加以佐證。美國食品藥品監督管理局（FDA）根據毒理學實驗結果指出食品中添加GABA是安全的，使用範圍包含飲料、咖啡、茶和口香糖等，但不允許在嬰兒食品、肉製品或含肉產品中添加。中國衞生部2009年12號公告，GABA攝入量不得超過500mg/d，使用範圍為飲料、可可製品、巧克力及其飲料、糖果、焙烤食品和膨化食品，但嬰兒食品中不能添加。 ^[6] 

GABA在動植物以及微生物中有較多的發現，其中在1949年首先在馬鈴薯的塊莖中發現，在1950年又在哺乳動物的中樞系統中發現其存在，同時被認為是哺乳動物、昆蟲或者某些寄生蠕蟲神經系統中的神經抑制劑，對神經元的興奮程度有着重要的影響。 ^[2]  研究發現 , GABA 是在人腦能量代謝過程中起重要作用的活性氨基酸 ,它具有激活腦內葡萄糖代謝、促進乙酰膽鹼合成、降血氨、抗驚厥、降血壓、改善腦機能、精神安定、促進生長激素分泌等多種生理功能。 ^[9] 

研究口服給予γ-氨基丁酸對改善小鼠睡眠的影響。方法：將小鼠分為A,B,C三批進行實驗，每批五組，分別為陰性對照組，陽性對照組和低、中、高劑量組.連續給予γ-氨基丁酸(50，100，150mg/kg)30天，進行了四項睡眠功效評價實驗。結果：中、高劑量γ-氨基丁酸口服後，可以延長睡眠時間，增加閾下劑量入睡動物數，不能縮短睡眠潛伏期.各組均無直接睡眠作用.結論:本實驗條件下，γ-氨基丁酸經口服具有改善睡眠的功效。 ^[10] 

富含GABA酸奶80 mg/kg，160 mg/kg劑量組小鼠入睡率均由0顯著提高至60%(p<0.05)；富含GABA酸奶(80 mg/kg)組能將小鼠睡眠時長由43.40 min顯著延長至156.20 min(p<0.05);在失眠實驗中，與失眠模型組比，富含GABA酸奶能夠顯著增加失眠小鼠腦組織中抑制性氨基酸GABA和Gly的含量(p<0.05),GABA含量升至1.10 ng/mL，Gly含量升至28.78 ng/mL.本研究結果顯示,富含GABA酸奶能夠有效延長ICR小鼠的睡眠時長，改善小鼠的失眠狀態，其機制與增加小鼠腦內抑制性遞質GABA及Gly的含量有關。 ^[11] 

良好的睡眠對於維持人體的生理健康及精神健康至關重要。目前用於治療失眠的鎮靜催眠藥普遍存在一定的安全隱患，對其應用造成了限制。一些食品及藥食兩用植物中的活性成分可以作用於人體中樞神經系統，改善睡眠質量，且服用方式符合人們的日常飲食習慣，安全性高,是改善輕度睡眠障礙的有效替代方法。 ^[12] 

根據《保健食品檢驗與評價技術規範》對改善睡眠保健食品的判定依據，酪蛋白水解物與y-氨基丁酸的復配製劑具有一定的改善睡眠作用。 ^[13] 

近年來，富含γ-氨基丁酸食品的研究與開發，成為國內外研究的熱點。.γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是一種重要的功能性非蛋白質氨基酸，他具有增進腦活力，安神，調解激素分泌，改善脂質代謝，降血壓等生物學功能，因此，GABA在食品上的開發應用具有廣闊的前景。 ^[14] 

在植物體中有兩條GABA合成和轉化途徑：一條是穀氨酸經穀氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化穀氨酸脱羧合成GABA，稱為GABA支路（GABA shunt）；另一條是由多胺降解產物轉化形成GABA，稱為多胺降解途徑（polyamine degradation pathway）。 ^[1] 

在高等植物中，GABA的代謝主要由三種酶參與完成，首先在GAD作用下，L-穀氨酸（glutamic acid，Glu）在α-位上發生不可逆脱羧反應生成GABA，然後在GABA轉氨酶（GABA transaminase，GABA-T）催化下，GABA與丙酮酸和α-酮戊二酸反應生成琥珀酸半醛，最後經琥珀酸半醛脱氫酶（succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH）催化，琥珀酸半醛氧化脱氫形成琥珀酸最終進入三羧酸循環（krebs circle）。這條代謝途徑構成了TCA循環的一條支路，稱為GABA支路。 ^[1] 

在植物中，存在於細胞質中的GAD和線粒體中的GABA-T、SSADH共同調節GABA支路代謝，其中GAD是合成GABA的限速酶。植物GAD含有鈣調蛋白（CaM）結合區，GAD活性不僅受Ca²⁺和H⁺濃度的共同調控，還受到GAD輔酶——磷酸吡哆醛（PLP）以及底物穀氨酸濃度的影響。這種雙重調節機制將GABA的細胞積累與環境脅迫的性質和嚴重程度聯繫起來。冷激、熱激、滲透脅迫和機械損傷均會提高細胞液中Ca²⁺濃度，Ca²⁺與CaM結合形成Ca²⁺/CaM複合體，在正常生理pH條件下能夠刺激GAD基因表達，提高GAD活性；而酸性pH刺激GAD的出現是由於應激降低細胞的pH，減緩細胞受到酸性危害。植物中GABA支路被認為是合成GABA的主要途徑。目前，大多數研究集中在如何提高GAD活性實現GABA富集。 ^[1] 

多胺（polyamine，PAs）包括腐胺（putrescine，Put）、精胺（spermine，Spm）和亞精胺（spermidine，Spd），其中以腐胺作為多胺生物代謝的中心物質。多胺降解途徑是指二胺或多胺（PAs）分別經二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）催化產生4-氨基丁醛，再經4-氨基丁醛脱氫酶（4-amino aldehyde dehydrogenase，AMADH）脱氫生成GABA的過程，多胺降解途徑最終與GABA支路交匯後參與TCA循環代謝。其中二胺氧化酶和多胺氧化酶是分別催化生物體內Put和Spd、Spm降解的關鍵酶。蠶豆發芽期間，厭氧脅迫可誘導多胺合成的關鍵性酶活性的提高，促進多胺的積累，同時多胺氧化酶活性也隨之提高，通過多胺降解途徑促進了GABA的合成與積累，提高了蠶豆的抗逆境能力。研究表明，大豆根中游離多胺含量在鹽脅迫下增加，DAO活力提高，GABA富集量增加11～17倍。儘管多胺降解途徑被認為是合成GABA的另一條重要途徑，但其在單子葉植物中合成GABA的能力遠低於GABA支路。 ^[1] 

在微生物中，GABA代謝是通過GABA支路完成的，利用微生物體內較高的GAD活性，將Glu脱羧形成 GABA，然後在GABA-T、SSADH作用下，GABA進入下游的分解過程生成琥珀酸半醛、琥珀酸參與微生物的生理代謝。微生物富集GABA就是通過對培養基的優化以及菌株的改良使其具有較高的GAD活性，增加GABA合成率，降低分解率來實現的。大量研究已證明GAD在原核到真核微生物中都有存在，此外，利用微生物中的GAD脱羧形成GABA不受資源、環境和空間的限制，與其他方法相比具有顯著的優勢。 ^[1] 

GABA長久以來被認為與植物多種應激和防禦系統有關。GABA會隨着植物受到刺激而升高，被認為是植物中響應於各種外界變化、內部刺激和離子環境等因素如pH、温度、外部天敵刺激的一種有效機制。GABA還可以調節植物內環境如抗氧化、催熟、保鮮植物等作用。近年來GABA在植物中也被發現作為信號分子在植物中傳遞擴大信息。GABA曾在大豆、擬南芥、茉莉、草莓等植物中相繼發現。低濃度的GABA有助於植物生長髮育，高濃度下又會起相反的作用。 ^[7] 

低pH下GABA會在細胞內快速增加，這種GABA的積累在微生物和動物中也存在。植物在酸性pH下細胞內 H⁺隨之升高，誘導細胞內GABA含量增加。該GABA的合成過程消耗H⁺，使得細胞內酸化得到緩解。在微生物中也存在這種快速的反應機制，在產生GABA的同時，會增加質子呼吸鏈複合物的表達，促進ATP合成。並且上調 F1F0-ATP水解酶活性，促進酸性條件下ATP依賴的H⁺排出過程。在動物中，細胞也會向外排出GABA和穀氨酸以此來改變細胞外環境的pH。更重要的是，GABA在生理環境下為兩性離子，因此在酸鹼調節中發揮着一定作用。 ^[7] 

GABA有助於植物對外界天敵的防禦。當昆蟲取食時由於植物受傷導致細胞破裂和組織受傷，這種機械切割會刺激植物中Ca²⁺的增加，植物在Ca²⁺刺激下分泌GABA作為一種抵禦昆蟲取食的措施。在此過程中不存在茉莉酸類信號參與GABA的積累。昆蟲存在離子型GABA受體，其中果蠅的GABA門控氯離子通道亞基RDL（resistant to dieldrin）是許多殺蟲劑藥物的作用靶標。GABA誘導使得GABA受體的單電流降低。具體為GABA在無脊椎動物中通過GABA受體門控的氯離子通道起作用，與大多數殺蟲劑相同，通過GABA受體氯離子通道，使Cl^－在電化學梯度的驅使下流向下游，導致質膜超極化，並抑制昆蟲取食。而在過量表達GABA的煙草植物中，接種北方線蟲，發現其雌性成年線蟲的繁殖能力整體下降，這種方式可以使植物達到防禦天敵的效果。在對女貞子被草食女娥幼蟲取食過程中，發現女貞子會降低自身賴氨酸活性使得蛋白質無營養，而女娥幼蟲在此期間會分泌甘氨酸、β-丙氨酸、胺等分子抑制植物賴氨酸的減少，這種植物與草食昆蟲的交流過程也證明了GABA作為信號分子的功能。 ^[7] 

在小麥開花期間噴灑GABA（200 mg/L），可以調節膜穩定性，增加抗氧化能力等，減少了小麥高温下的損失；外源GABA的施用對黃瓜幼苗生長也有明顯的作用。高温會抑制中樞GABA能神經元活性，激活膽鹼類神經系統並引起體温升高。長期處於高温下，下丘腦的GABA能神經元活性會增加以適應環境和調節體温。GABA會在血漿中升高進而抑制冷敏神經核血漿中兒茶酚胺的濃度，達到降低食道温度的目的。 ^[7] 

低温會降低植物的生物合成能力，對重要功能造成干擾，併產生永久性傷害。動物在低温下也會導致損傷甚至造成更嚴重的傷害。低温下生物GABA表達會上調，這與低温的耐受性存在關聯。在低温下，75%的代謝物會增加，包括氨基酸、糖類、抗壞血酸鹽、腐胺和一些三羧酸循環中間體。能量代謝涉及的氨基酸代謝，酶類的轉錄丰度均會增加。可以通過增強GABA分流途徑產生ATP以及積累GHB。另外低温下利用褪黑黴素可以使精胺、亞精胺和脯氨酸積累，促使二胺氧化酶表達升高。通過腐胺途徑合成GABA，使得H₂O₂積累和苯丙烷途徑通量下降以達到防腐和抗寒的效果。 ^[7] 

GABA分流作為三羧酸循環分支途徑的中間產物，與能量循環關係密切。同時GABA作為氧化代謝物的調控者發揮作用。將擬南芥SSADH突變體暴露於高温下生長，發現其活性氧中間體（reactive oxygen intermediate，ROI）積累，使得植株死亡， ^[7]  證明ROI與GABA存在關係。同樣SSADH和GABA－T基因的突變株在高温下存在大量的ROI，利用ROI消除劑N－叔丁基－α－苯基硝酮（PBN）可使GABA大量積累，從而提高酵母的存活率。因此，認為GABA分流途徑在抑制高温下ROI具有作用。在GABA分流過程中，SSA可以經由GLYR/SSAR轉化為GHB，而GHB與ROI存在密切關係。在SSADH缺失突變株中的GHB與ROI存在大量積累，而瓜巴特林可以抑制這種GHB與ROI的積累，並抑制了過氧化死亡。GABA分流過程可以減少ROI的積累使得生物免於高温帶來的氧化損傷以及過氧化衰亡。 ^[7] 

碳氮代謝平衡涉及許多生理過程，包括能量代謝、氨基酸代謝等。由於GABA合成和分流途徑涉及氮代謝，GABA也是能量循環中三羧酸循環的重要組成部分，GABA分流途徑與呼吸鏈競爭SSADH，因此長時間以來 GABA被認為是碳氮代謝的重要一環。三羧酸循環分支的穀氨酸合成GABA途徑是植物快速響應外部刺激的關鍵因素之一。絕大部分NH₃⁺是通過谷氨醯胺合成酶/穀氨酸合成酶途徑合成（glutamine synthetase/gluta-mate synthetase，GS/GOGAT），被認為是氨基酸的主要合成途徑。遊離的氨基分子大部分通過谷氨醯胺固定，穀氨酸被認為是植物老根中氮主要的積累形式，氮存儲於精氨酸等氨基酸中，同時精氨酸也可用於運輸，滿足生物體的氮需求。同樣氨基酸也通過轉化為三羧酸循環的前體或中間體參與能量代謝過程。在對菠菜的研究中發現脯氨酸佔總遊離氨基酸的8.1%～36.%，GABA佔12.8%～22.2%，穀氨酸佔5.6% ～21.5%。穀氨酸是GABA和脯氨酸的前體物質，低温下植物會使穀氨酸的氮分流進入GABA和脯氨酸調控氮的代謝途徑。另外在50mmol/L GABA下培養的擬南芥中除NADP⁺依賴性檸檬酸脱氫酶、根和芽中谷氨酰胺合成酶、芽中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶外，幾乎所有的初級氮代謝和硝酸鹽吸收有關的酶活性均受到影響。而在NaCl條件下培養的擬南芥中，發現GABA積累的同時帶動擬南芥整體氨基酸的增加。在分別利用不同氮化合物（10mmol/L NH₄Cl，5mmol/L NH₄NO₃，5mmol/L穀氨酸和5mmol/L的谷氨醯胺）作為唯一氮源培養的擬南芥葉片中，其GAD活性和蛋白質水平不同，説明GAD在氮代謝中發揮作用。 ^[7] 

在NO脅迫下的香蕉中也發現了GAD活性上升、GABA和香蕉多巴胺增加的現象。鹽脅迫下穀氨酸脱氫酶活性與GAD的表達瞬時上升，進而提高GABA分流等相關途徑的通量以調節碳氮平衡。應激下NADH：NAD⁺和 ADP：ATP的比值也能影響GABA-T，從而使GABA積累。鹽脅迫下植物更多地利用C/N平衡途徑緩解壓力。 ^[7] 

20世紀末，人們就發現乾旱可以降低根的固氮和O₂的擴散，使得植物缺氧而導致GABA的積累。低氧條件下穀氨酸和天冬氨酸含量增加。乾旱下GAD活性提高，GABA-T快速積累。乾旱條件下，根系、莖的生長和葉面積伸展被抑制，活性氧增加，低分子滲透調節物質如GABA等氨基酸、多元醇、有機酸產量增加，以及抗氧化損傷的酶表達均上調。研究表明，乾旱條件下，與細胞內穩態、活性氧的清除、結構蛋白穩定保護、滲透調節劑、轉運蛋白等有關的基因表達上調。外源GABA使得植物保持較高的相對含水量，降低電解質滲漏、脂質、過氧化物、碳代謝並能提高膜穩定性。此外，外源GABA也可以誘導GABA-T和α-戊酸脱氫酶活性上升，抑制GAD活性使得GABA和穀氨酸增加。同時GABA加速多胺合成，抑制多胺分解，並進一步激活σ-1-吡咯林-5-羧酸合成酶和脯氨酸脱氫酶以及鳥氨酸-σ-氨基轉移酶活性，致使GABA預富集物的高度積累和代謝。GABA還可以通過促進葉綠素表達，進而使得過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POX）活性增加，提高脯氨酸和糖含量，調節滲透和降低氧化。植物在水澇下pH會下降。長時間水澇會使土壤缺氧且短時間內水澇使得GABA升高。而水澇下氣孔關閉與脱落酸存在直接關係。由於H⁺上升和缺氧會導致GABA增加。同時丙氨酸的積累可提高缺氧條件下植物的生存能力。在缺氧條件下GABA可以通過間接調節使得光合作用增強，降低氣孔限制值，使得通氧量加大。缺氧條件下GAD活性上升，而GABA可以緩解缺氧對植物幼苗的傷害，而且外源GABA可以使低氧條件下根生長抑制得以緩解，快速生長出不定根。不定根生長也可以緩解植物的缺氧情況。 ^[7] 

另外，水澇缺氧條件下除GABA、穀氨酸以及丙氨酸外其他與三羧酸循環有關的氨基酸水平均下降。GABA與穀氨酸可作為丙氨酸的直接合成底物，通過這種厭氧途徑生成2倍於糖酵解產生的ATP，保證供能。GABA還具有消除活性氧中間體以及為植物解毒和間接通過H₂O₂信號作用防止細胞程序性死亡（programmed cell eath，PCD），以及發揮其他作用。 ^[7] 

50mmol/L GABA和不同鹽濃度會對植物幼苗產生不同的影響，當NO₃^-離子低於40mmol/L時，GABA會刺激根伸長，當NO₃^-離子大於40mmol/L時GABA會抑制根伸長。並且GABA刺激低濃度的NO₃^-吸收，抑制高濃度NO₃^-的攝取，而GS等酶被氮調控，以上研究認為氮對調控植物生長有一定作用。在NaCl（50mmol/L）刺激下，植物的糖基化代謝會發起變化，並影響包括三羧酸循環、GABA代謝、氨基酸合成和莽草酸介導的次級代謝等發生變化。較高的鹽離子會導致大豆的多胺氧化降解為GABA。植物GABA受體具有調節pH和Al³⁺的根耐受性。 ^[7] 

細菌侵染過程中的植物GAD表達量和γ-羥基丁酸轉錄丰度會上升，致使GABA升高。高GABA合成水平的煙草對根癌土壤桿菌C₅₈感染敏感性有所下降。GABA可誘導農桿菌ATTKLM操縱子表達，使得N-（3-氧代辛酰基）高絲氨酸內酯的濃度減少，羣體感應信號（或激素）下調，影響其對植物的毒性。GABA在植物與細菌的信號交流中也發揮作用，GABA可以抑制細菌內Hrpl基因表達（Hrpl基因編碼蛋白使得植物致敏或引起其組織疾病），同時抑制植物體內hrp基因表達，使得植物免於過敏反應（hrp：控制植物病原體致病能力，並引起過敏反應）。 ^[7] 

此外，GABA還具有催熟作用。GABA可以通過刺激1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶轉錄丰度刺激乙烯生物合成。而水澇下乙烯可以通過促進不定根的生長為植物提供氧氣。高濃度GABA可抑制植物和細菌GABA轉氨酶（GABA-T，GABT）突變體的生長，高濃度下可抑制細菌在植物內的繁殖。番茄中的GABA-T被抑制會導致GABA的積累，使番茄出現矮小症。 ^[7]