農桿菌

在自然界中，絕大多數的植物都是從土壤中生長出來的，它們從土壤中吸取營養和水分，同時也會被土壤中的各種細菌所侵染而致病。在眾多的土壤細菌中，有兩種農桿菌(Agrobacterium)一直是世界各國科學家們研究的熱點，一種被稱為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，另一種被稱為髮根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。它們都是革蘭氏陰性菌，同屬於根瘤菌科(Rhizobiacease)。這兩種農桿菌之所以受到重視，主要就是因為它們都攜帶有一種特殊的質粒，這些質粒都可以被用於植物基因工程的遺傳轉化研究中 ^[2]  。

農桿菌主要有兩種：根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和髮根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌農桿菌的Ti質粒和髮根農桿菌的Ri質粒上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系，被譽為“自然界最小的遺傳工程師” ^[3]  。可以通過將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移和整合，然後通過細胞和組織培養技術，得到轉基因植物。

農桿菌介導法起初只被用於雙子葉植物中，農桿菌的介導轉化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應用。此外，生物技術學家還可以通過髮根農桿菌轉化，在液體培養基中培養高密度的根，作為一種在轉基因植物中獲得大量蛋白質的方法。

農桿菌Ti質粒的T-DNA可高效率地整合到植物受體細胞的染色體上並得到表達。利用這一特點，Marton等(1979)以植物原生質體為受體首創了“共培養法”(co-cultivation)。後來經過一系列改進，特別是Horsch等(1985)建立的“葉盤共培養法”(leaf discco-cultivation)，使這種轉化方法更加實用。

所謂“共培養法”是指將根癌農桿菌與植物的原生質體、懸浮細胞、葉盤、莖段等放在一起共同培養而實現轉化的方法。首先用打孔器從消毒的葉片上取得葉網片，亦稱之葉盤，將其放在對數生長期的農桿菌的菌液中浸泡數秒鐘後，置於培養基上共同培養2～3d。待葉盤周圍的菌株生長至肉眼可見菌落時，轉移到含有抑菌劑的培養基中除去農桿菌，同時在該培養基中加入抗生素進行轉化體選擇，經過3～4周的組織培養即可獲得轉化的再生植株。世界上已有的轉基因植物，大多數是通過農桿菌介導法得到的 ^[4]  。

根癌農桿菌生活在土壤，特別是耕種過的田地裏，因為經過耕種的土壤疏鬆，適宜根癌農桿菌生長。根癌農桿菌的菌體為棒狀，有兩三個微米長，靠幾根鞭毛運動，鞭毛一般生在側邊。用顯微鏡放大到1000倍時，人們就能把它看得很清楚了。

在許多雙子葉植物靠近地面的根莖交界處，根癌農桿菌能誘發一種帽狀腫瘤，人們稱之為冠癭瘤病。這種病曾在法國、東歐和澳大利亞的葡萄等果樹上大面積發生，造成很大的危害。在其他地方，甚至城市園林綠化中，也有不少植物患上此病。

人們發現，根癌農桿菌所產生的冠癭瘤病，與豆科植物根部的固氮根瘤細菌所產生的根瘤相似；然而，事實上，兩者的作用方式並不一樣。

豆科植物的固氮根瘤菌會鑽到植物細胞內部，與植物細胞共生，農桿菌卻不於植物共生，根瘤細菌為豆科植物提供氮肥，（農桿菌多在雙子葉植物中）植物細胞則供給根瘤細胞其他各種營養。

根癌農桿菌侵染植物是一個非常複雜的過程。根癌農桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產生一些糖類和酚類物質吸引根癌農桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在於單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根癌農桿菌侵染的原因。還發現一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導作用。酚類物質和糖類物質既可以作為根瘤農桿菌的趨化物，又可以作為農桿菌中Ti質粒上 Vir區（毒性區）基因的誘導物，使Vir區基因活化，導致T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞 ^[5]  。

需要注意的是農桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。GV3101、AGL1、LBA440、EHA105等都有不同的特性，利用農桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加上述酚類物質的，同時單子葉植物種類不同，農桿菌侵染進行遺傳轉化的效果也有很大差異 ^[5]  。

如果想將一個抗病毒基因轉入小麥，也可以用農桿菌，但要注意兩點：

①要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；

②要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的Vir區（誘導）的基因，使T-DNA轉移並插入到染色體DNA上 ^[6]  。