噬菌體展示技術

到2017年為止，人們已開發出了單鏈絲狀噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統等數種噬菌體展示系統。

噬菌體展示技術是將多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閲讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利於靶分子的識別和結合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經過一定時間孵育後，洗去未結合的遊離噬菌體，然後以競爭受體或酸洗脱下與靶分子結合吸附的噬菌體，洗脱的噬菌體感染宿主細胞後經繁殖擴增，進行下一輪洗脱，經過3輪～5輪的“吸附-洗脱-擴增”後，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集[2]。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結合特性的目標噬菌體。 ^[1] 

2.1 單鏈絲狀噬菌體展示系統

（1）PⅢ展示系統。絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位於病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個病毒顆粒都有3個～5個拷貝PⅢ蛋白[3]，其在結構上可分為N1、N2和CT 3個功能區域[4-5]，這3個功能區域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細胞膜有關[6]，而CT構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分，並將整個PⅢ蛋白的C端結構域錨定於噬菌體的一端[7]。PⅢ有2個位點可供外源序列插入，當外源的多肽或蛋白質融合於PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時，該系統保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結構域相連，則噬菌體喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時，可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，即所謂“單價”噬菌體。

（2）PⅧ及其他展示系統。PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位於噬菌體外側，C端與DNA結合，N端伸出噬菌體外，每個病毒顆粒有2 700個左右PⅧ拷貝[8-9]。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配[2，10-11]，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價數，此時可融合多肽甚至抗體片段。 此外，尚有絲狀噬菌體PⅥ展示系統的研究報道[12]。PⅥ蛋白的C端暴露於噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點，可以用於研究外源蛋白C端結構區域功能。從所掌握的文獻來看，該系統主要用於cDNA表面展示文庫的構建，並取得了不錯的篩選效果。

2.2 λ噬菌體展示系統

（1）PV展示系統。λ噬菌體的PV蛋白構成了它的尾部管狀部分，該管狀結構由32個盤狀結構組成，每個盤又由6個PV亞基組成。PV有兩個摺疊區域，C端的摺疊結構域（非功能區）可供外源序列插入或替換。用PV系統已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（5 ku）和植物外源凝血素BPA（120 ku）等[13]。λ噬菌體的裝配在細胞內進行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質。該系統展示的外源蛋白質的拷貝數為平均1個分子/噬菌體，這表明外源蛋白質或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。

（2）D蛋白展示系統。D蛋白的分子質量為11 ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低温電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面[13]。當突變型噬菌體基因組小於野生型基因組的82%時，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結合到λD-噬菌體表面，而體內組裝是將含D融合基因的質粒轉化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補償溶源菌所缺的D蛋白，通過熱誘導而組裝。該系統有一個很好的特點，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對於展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質時特別有用。

2.3 T4噬菌體展示系統

T4噬菌體展示系統是20世紀90年代中期建立起來的一種新的展示系統。它的顯著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源多肽或蛋白質，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融合而直接展示於T4噬菌體的表面，因此它表達的蛋白不需要複雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細胞內裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質，很少受到限制。吳健敏等成功地將大小約215 aa SOC/m E2融合蛋白展示於T4噬菌體衣殼表面[14]。令人值得關注的是，SOC與HOC蛋白的存在與否，並不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時可優於DNA的包裝而裝配於衣殼的表面，事實上，在DNA包裝被抑制時，T4是雙股DNA噬菌體中能夠在體內產生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景[14]。 ^[1] 

（1）在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、噬菌體包裝，有的展示系統還要經過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數量一般限制在109。

（2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質功能的實現需要摺疊、轉運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗中，由於部分未摺疊的蛋白在細菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達差，也是體內選擇壓力的一個例子。真核細胞蛋白在細菌中表達差是因為它們的蛋白質合成與摺疊機制不同的緣故[15]。

（3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。

（4）由於噬菌體展示系統依賴於細胞內基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。 ^[1] 

確定抗原表位，包括表位的序列和構象，是免疫學家感興趣的一個問題。表位的確定不僅可以瞭解有關免疫反應的眾多信息，為進一步人工控制免疫反應奠定基礎，而且對藥物合成、疫苗設計等也具有指導意義。確定表位常用的方法有：還原法、蛋白印跡法、肽掃描、突變分析等，後兩種方法還同時解決了蛋白分子一級序列問題。但這些方法大多困難而繁瑣。

00年以後，噬菌體展示技術成為探測蛋白空間結構、探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋找高親和力和生物活性的配體分子的有利工具，在蛋白分子相互識別的研究、新型疫苗的研製以及腫瘤治療等研究領域產生了深遠的影響。肽庫（peptide library）的應用為確定表位序列以至其構象提供了另一有力工具。

噬菌體展示肽庫是以噬菌體外殼蛋白PⅢ或PⅧ基因為載體，插入一段編碼外源短肽的基因片段，噬菌體的浸染能力不受到影響，而外源短肽亦可在噬菌體表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空間構象。1990年Scott將隨機短肽與絲狀噬菌體的表面蛋白PⅢ融合，並展示在噬菌體表面，首次建立了噬菌體隨機肽庫。

從噬菌體展示隨機肽庫中篩選抗原表位的基本原理是生物淘選（biopanning）。以單克隆抗體篩選蛋白質抗原表位為例，其基本技術流程如下：將單抗包被聚乙烯平皿後，再加入噬菌體展示肽庫，使其充分與單抗反應後，洗去未結合的遊離噬菌體，再用洗脱液將結合狀態的噬菌體洗脱下來。將其浸染宿主大腸桿菌擴增後回收，再進行下一輪篩選。通常經過3、4輪的篩選，並且每次增加篩選強度，這樣就可獲得與單抗結合較緊密的噬菌體克隆。通過序列測定和分析，就能推知該噬菌體克隆所攜帶的外源短肽序列，從而確定該單抗所針對的抗原表位。

藉助於噬菌體展示肽庫技術，已經成功分析了多種蛋白質抗原的表位，如HIV（Keller et al., 1993； 杜勇等，2000）、HBV、HCV（杜勇等，1999；Francesca et al., 2001；潘衞等，2001）、日本血吸蟲（歐陽理等，2002）等，説明完全可以利用隨機肽庫鑑定抗原的線性和構象表位，大大簡化了重組免疫原的克隆、鑑定和表達等過程，為表位鑑定研究增添了新的手段。

絲狀噬菌體具有免疫原性，無須佐劑即可產生抗體，這意味着噬菌體展示系統可以作為候選疫苗抗原表位的遞呈工具。利用展示肉毒梭菌中和表位的噬菌體不加佐劑直接免疫小鼠，血清ELISA檢測顯示，免疫小鼠是對照小鼠的OD值的2~10倍。表明噬菌體展示的表位具有明顯的抗原性。

噬菌體展示技術的優點 噬菌體展示技術作為一種新興的研究方法和工具，在研究蛋白質結構上已被廣泛應用。它具有很多顯著的優點，如：

A.高通量的淘選　將靶標分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體的數量可達1011 PFU），利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結合的噬菌體洗脱下來，如此反覆數輪擴增、淘選，即可將有用的基因從多達百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。

B.可用於模擬表位的篩選利用噬菌體展示技術得到模擬表位的報道較多（Giuseppe, 2001；Seshi et al., 2002；Ouyang et al., 2003）。李全喜等（1997）利用單抗9E10篩選噬菌體隨機肽庫，結果獲得了兩個陽性克隆，其中一個與抗原天然序列同源，而另一個則完全不同（即為模擬表位）。模擬表位同樣可誘發與天然表位相似的特異性免疫反應，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導產生高滴度的乙肝病毒抗體。

C.易於純化重組噬菌體的純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設備，在一般的實驗室條件下就可以完成。用於鑑定表位和受體所用的噬菌體載體為13單鏈噬菌體。由於M13噬菌體是温和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養基中，通過離心收集培養上清，再向其中加入沉澱劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉澱下來，從而富集得到含外源基因產物的重組噬菌體。 ^[2] 

儘管如此，在噬菌體展示技術中仍然存在一些不足。首先，所建的肽庫容量只能達到10⁹，要想構建大片段的肽庫很困難。其次，需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數多肽由於疏水性過強，或由於影響外膜蛋白的摺疊而不能展示在噬菌體表面。作為一種新技術，類似的具體問題還很多。但這些暫時的缺點並不能掩蓋其巨大應用潛力。 ^[2] 

1985年，Smith G P[1]第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創建了噬菌體展示技術。該技術的主要特點是將特定分子的基因型和表型統一在同一病毒顆粒內，即在噬菌體表面展示特定蛋白質，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結構基因。另外，這項技術把基因表達產物與親和篩選結合起來，可以利用適當的靶蛋白將目的蛋白或多肽挑選出來。 ^[1] 

隨着噬菌體展示技術的日益完善，該技術在眾多基礎和應用研究領域產生的影響已日漸明顯。