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多肽

鎖定
肽是α-氨基酸肽鍵連接在一起而形成的化合物,是蛋白質水解的中間產物。由兩個氨基酸分子脱水縮合而成的化合物叫做二肽,同理類推還有三肽、四肽、五肽等。由三個或三個以上氨基酸分子組成的肽叫多肽。
中文名
多肽
外文名
polypeptide
分    類
有生物活性多肽和人工合成多肽兩種
定    義
由10~100個氨基酸分子脱水縮合而成的化合物

多肽肽簡介

肽(peptide)是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物,它也是蛋白質水解的中間產物。
一般肽中含有的氨基酸的數目為二到九,根據肽中氨基酸的數量的不同,肽有多種不同的稱呼:分別叫二肽三肽、四肽、五肽等。由三個或三個以上氨基酸分子組成的肽叫多肽它們的分子量低於10,000Da,能透過半透膜,不被三氯乙酸硫酸銨所沉澱。也有文獻把由2~10個氨基酸組成的肽稱為寡肽(小分子肽);10~50個氨基酸組成的肽稱為多肽;由50個以上的氨基酸組成的肽就稱為蛋白質,換言之,蛋白質有時也被稱為多肽。多肽也簡稱為肽,是20世紀被發現的。

多肽醫學領域

原有的多肽類藥物一般是多肽類激素,現對多肽類藥物的開發已經在多個領域得到了大量的使用,多肽類藥物的應用主要在於以下幾個方面:
  1. 1細胞因子模擬肽
利用已知細胞因子的受體從肽庫內篩選細胞因子模擬肽,近年成為國內外研究的熱點。國外已篩選到了人促紅細胞生成素,人促血小板生成素,人生長激素、人神經生長因子及白細胞介素等多種生長因子的模擬肽,這些模擬肽的氨基酸序列與其相應的細胞因子的氨基酸序列不同,但具有細胞因子的活性,並且具有分子量小的優點。這些細胞因子模擬肽正處於臨牀前或臨牀研究階段。
2.抗菌性活性肽
當昆蟲受到外界環境刺激時產生大量的具有抗菌活性的陽離子多肽,已篩選出百餘種抗菌肽,體內外實驗證實,多個抗菌肽不僅有很強的殺菌能力還能殺死腫瘤細胞。例如,從蠶體內篩選的抗菌肽D表現了很好的應用前景,並能利用基因工程技術生產。蛇毒內也存在多種活性多肽,從蛇毒內分離出一個13個氨基酸的小肽,其對G+及G-菌均有殺菌能力。
3.用於心血管疾病的多肽
很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用,不僅可用作藥物,亦可用作保健食品。但由於其作用成份不能確定,其應用受到很大限制。現已發現很多有效成分是小分子多肽,比如我國科學家從大豆內加工分離出的活性多肽,可通過小腸直接吸收,能防治血栓,高血壓和高血脂,還能延緩變老,提高肌體抗腫瘤能力。從人蔘、茶葉、銀杏葉等植物內也分離出很多用於心血管疾病的小肽。
4.其他藥用小肽
小肽藥物除在上述幾大方面已取得較大進展外,在其它很多領域也取得一些進展。比如Stiernberg等發現一個合成肽(TP508)肽能促進傷口血管的再生,加速皮膚深度傷口的癒合。Pfister等發現一個小肽能防止鹼損傷角膜內炎症細胞的侵潤,抑制炎症反應。Carron等證實其篩選的2個合成肽能抑制破骨細胞對骨質的重吸收。
5.診斷用多肽
多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體,多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強,且易於製備,因此裝配的檢測試劑,其檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低,易於臨牀應用。用多肽抗原裝配的抗體檢測試劑包括:甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人鉅細胞病毒單純皰疹病毒風疹病毒梅毒螺旋體、囊蟲、錐蟲、萊姆病及類風濕等。使用的多肽抗原大部分是從相應致病體的天然蛋白內分析篩選獲得,有些是從肽庫內篩選的全新小肽。

多肽多肽對人體影響

活性肽主要控制人體的生長、發育、免疫調節和新陳代謝,它在人體處於一種平衡狀態,若活性肽減少後,人體的機能發生重要變化,對於兒童來説,他的生長、發育變得緩慢,甚至停止,長久下去就形成了侏儒,對成年人或老年人,缺少活性肽後,自身的免疫力就會下降,新陳代謝紊亂,內分泌失調,引起各種疾病的產生,如失眠、身體消瘦或浮腫。由於活性肽還作用於神經系統,因此人體就會變得動作遲緩,頭腦不再聰慧,更主要的是活性肽減少,直接引起人身體各部位逐漸出現全面衰老,引發各種疾病。

多肽分泌週期

在不同的年齡時期,各種活性肽的分泌量也有很大差別,按分泌量劃分,人的一生一般可分為:
①分泌充足期(25歲以前的青年期):這個時期內分泌量均衡、免疫功能強勁,人體一般不易出現疾病;
②分泌不足期(失衡期)(30—50歲壯年和中年期):這一時期如果活性肽分泌不足或失衡會出現各種相關的亞健康狀態和輕微疾病症狀(40歲以上的人羣常見);
③分泌匱乏期(嚴重不足期)(50歲以上中年和老年期):這一時期嚴重如果活性肽嚴重不足和嚴重失衡,可能出現非常突出的衰老症狀,或會引起各種相關疾病發生(50歲以上人羣比較明顯);
④分泌終止期(衰老期):這一時期很短,由於控制人體內分泌的“司令官”活性肽不分泌或分泌減少,從而導致細胞功能衰退,引發器官功能衰竭和喪失,最後導致生命終結。

多肽肽的重要性

人體很多活性物質都是以肽的形式存在的。肽涉及人體的激素、神經、細胞生長和生殖各領域,其重要性在於調節體內各個系統和細胞的生理功能,激活體內有關酶系,促進中間代謝膜的通透性,或通過控制DNA轉錄或影響特異的蛋白合成,最終產生特定的生理效應。肽是涉及人體內多種細胞功能的重要物質。肽可以合成細胞,並調節細胞的功能活動。肽在人體作為神經遞質,傳遞信息。肽可在人體作為運輸工具,將人體所食的各種營養物質與各種維生素、生物素、鈣及對人體有益的微量元素輸送到人體各細胞、器官和組織。肽是人體重要的生理調節物,它可全面調節人體生理功能,增強和發揮人體生理活性,它具有重要的生物學功能。

多肽保存方式

多肽類保健食品只需置於陰涼乾燥處即可。
對於多肽試劑和多肽類藥物則需要保存在乾燥器中。在將它們暴露於空氣之前, 冷凍乾燥多肽可以放於室温。這將是濕度影響減少,當無法冷凍乾燥時,最好的方法是以小的工作樣量存放。對於含Cys, Met或者TrP的多肽試劑,脱氧緩衝劑對其溶解必不可少,因為這種多肽試劑易被空氣氧化,在封瓶前,慢慢流過多肽試劑的氮氣氬氣也會降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽試劑也容易降解,所有這些肽與不含這些有問題解苷的那些肽相比,生命期有限。
多肽具廣泛的溶解性。多肽不溶的主要問題是形成二級結構。除了最太肽外,這點都會發生, 在有多重疏水殘基的肽中更顯著。鹽會促進二級結構形成。我們建議先在無菌蒸餾水或去離子中溶解多肽。如需要增加溶解率, 可用超聲處理。溶解仍有問題, 加少量稀乙酸(10%)或氨水,會便於溶解。
要長期保存多肽試劑,最好冷凍乾燥,冷乾粉可在-20℃或更低存放幾年而很少或無降解。溶液中的多肽遠不穩定。 多肽易受細菌降解,應用無菌純化水溶解。
含有Met,Cys或Tyr殘基的多肽溶液由於氧化,壽命有限。應溶於無氧溶劑, 為防止重複凍融的破壞, 建議溶解過量的肽的便實驗,其餘多肽以固體形成保存。

多肽溶解性

大多數肽的首選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對於鹼性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽, 需要DMF等來溶解。

多肽合成過程

具體合成由下列幾個循環組成:

多肽除去保護

Fmoc保護的柱子和單體必須用一種鹼性溶劑(piperidine)去除氨基的保護基團。

多肽激活和交聯

下一個氨基酸的羧基被一種激活劑所激活。化學工藝常用HBTU/HCTU/HITU/HATU+NMM/DIPEA或HOBT+DIC作激活劑,激活的單體與遊離的氨基反應交聯,形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環:這兩步反應反覆循環直到合成完成。 氨基酸縮合結束後,可用適量TFA進行洗脱,根據起酸鹼性,可選擇10%TFA/DCM溶液,至100%TFA,以此類推。

多肽HPLC分析純化

分析HPLC使用柱子和泵系統,可以經受傳遞高壓,這樣可以用極細的微粒(3-10μm)做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。HPLC分兩類:離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH範圍帶有特定電荷衍變成一種離子體,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用,通過可變PH,離子強度,或兩者洗脱出多肽,通常,先用低離子強度的溶液,以後逐漸加強或一步一步加強,直到多肽火柱中洗脱出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性pH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反,多肽通過疏水作用連到柱上,用降低離子強度洗脱, 如增加洗脱劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成,這種鏈長度為G4-G8碳原子。 由於洗脱是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的, 高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脱好。 然而,總體實踐中, 這兩類柱互變無多少顯著差別,別類載體由碳水化合物構成, 比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μm)和22×250mm(10μm)。如果用徑向填柱,那麼大小是8×100(3-10μm)和25×250mm(10μm)。
大量各種緩衝劑含許多不同試劑,比如磷酸、NH4HCO3、 醋酸鈉、TFA/TEA,磷酸鈉、異戊酚等。這樣許多不同組合可形成緩衝劑,但要注意:硅反相柱料不能長時間暴露於高pH,甚至微鹼pH, 因為這樣會破壞柱子。
不要把肽含量和純度搞混了,肽的純度可能是100%, 而肽含量相關帶電基團(如Arg, Lys )的抗離子量和肽親水性決定,這是合成肽的本身特性。