酶聯免疫吸附劑測定

1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用於IgG定量測定的文章，使得1966年開始用於抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺有無定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

常用的ELISA可以分為以下五大類：①直接ELISA；②間接ELISA；③夾心ELISA；④競爭ELISA；⑤競爭抑制ELISA。其他的ELISA都隸屬於這五類ELISA或由這五類ELISA組合衍生。 ^[2] 

其方法是將抗原按一定的比例稀釋好包被到固相載體上，然後加入稀釋好的特異性的酶標抗體，孵育後加入底物顯色並判讀結果。直接ELISA操作很簡單，步驟也比較簡練，但是其應用範圍還是非常有限的，一個重要的原因是這種ELISA中只經過了一步信號放大（酶的放大），所以其靈敏度不是很高；另外，其測定的對象也非常有限，只能測定酶標記的分子。

間接ELISA與直接ELISA不同的是，間接ELISA中與包被好的抗原結合的是非酶標抗體，另外再引入第二種抗體（即二抗）。二抗是經過酶標的，它可以與第一種抗體特異性結合，最後加入底物顯色並判讀結果。由於二抗一般為多抗，因此，一個一抗分子上可以結合多個二抗分子，同時，一個二抗分子上可以標記上多個酶分子，所以當待測抗體為多抗時，信號經過兩步放大，最終提高了檢測的靈敏度。另外，由於二抗製備比較容易，而且很早就開始商品化，所以操作者無需要將一抗進行酶標，大大縮減了工作量。在檢測抗體的效價、血清的效價以及單克隆抗體的篩選過程中，間接ELISA都是非常重要的實驗過程，在臨牀診斷中，間接ELISA也是檢測標誌性抗體的重要手段。

夾心ELISA總體上可以分為兩種，直接夾心ELISA和間接夾心ELISA。

直接夾心ELISA又分為雙抗體夾心ELISA和雙抗原夾心ELISA。

雙抗體夾心ELISA的方法是將第一種抗體（捕獲抗體）包被在固相載體上，封閉後加入待檢抗原，温育後加入第二種抗體（檢測抗體），捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單抗，也可以是針對同一抗原的一種單抗與一種多抗，但是檢測抗體需要經過酶標。

雙抗原夾心ELISA的原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同，不同的是包被的是抗原，待檢對象是抗體，然後加入酶標抗原，再加底物顯色。

對於雙抗體夾心ELISA，待檢對象必須包括兩個或者兩個以上的表位，否則檢測抗體無法與待檢抗原結合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用雙抗體夾心ELISA檢測的。對於雙抗原夾心ELISA，其操作與間接ELISA基本相同，但利用特異性的抗原代替酶標二抗，所以特異性比間接法更好。另外，由於間接ELISA中使用的二抗一般只能識別IgG，而雙抗原夾心ELISA中任何類似的免疫球蛋白都可以被檢測出，因此，雙抗原夾心ELISA比間接ELISA也更靈敏。

間接夾心ELISA是基於兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA，其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被於固相載體上（作為捕獲抗體），封閉，加入待檢抗原，温育，洗滌後加入另一種種屬來源的特異性抗體（非酶標，作為檢測抗體），最後加入酶標二抗（特異性識別檢測抗體），再加底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比，間接夾心ELISA中引入了特異性識別檢測抗體的酶標二抗，相當於整個體系的信號增加了一步放大系統，於是最終的結果比直接雙抗夾心ELISA更靈敏。同時，由於間接夾心ELISA中的酶標二抗僅能識別檢測抗體，而不能識別捕獲抗體，所以體系的特異性也得到了保障。

本法首先將特異性抗體吸附於固相載體表面，經洗滌後分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液；而另一組只加酶標記抗原，再經孵育洗滌後加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個結合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。

預先將抗原包被在固相載體上，實驗時加入稀釋好的待檢抗原（或抗體），然後依次加入特異性的抗體以及此抗體對應的酶標二抗。待檢標本中的抗原（或抗體）就和預製備體系中固相載體上結合的抗原（或抗體）競爭結合特異性的抗體（或固相載體上結合的抗原）。洗掉被競爭的特異性抗體，最後加底物顯色。最終顯色的結果與待檢抗原（或抗體）量呈反比。 ^[2] 

不管是哪一種ELISA，它的操作都由以下幾種基本的操作組合而成：①將抗原或抗體吸附到固相載體上；②加入待檢樣品以及後續試劑；③温育；④洗滌去掉遊離未結合的反應物；⑤加入酶檢測底物；⑥結果的判讀。 ^[2] 

夾心法常用於檢測大分子抗原，一般的操作步驟為：

間接法常用於檢測抗體，一般的操作步驟為：

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用於檢測小分子抗原，其操作步驟為：

當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著於孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。

親和素是一種糖蛋白，一分子親和素可以與四個生物素小分子發生專一親和作用，類似抗原與抗體親和。它們之間的作用力是已知最強的非共價作用。80年代後，隨着生物素-親合素系統（BAS）作用被發現，這一親和作用被結合應用到ELISA技術上，大大提高了後者反應的靈敏性與專一性。生物素很易與蛋白質（如抗體等）以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由於酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原（或抗體）分子的目的。

定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋後進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。

在間接法和夾心法ELISA中，陽性孔呈色深於陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深於陽性孔。

ELISA操作步驟複雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下製作標準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA，標準曲線的範圍一般較寬，曲線最高點的吸光度可接近2.0，繪製時常用半對數值，以檢測物的濃度為橫座標，以吸光度為縱座標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨於平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區域。

測定小分子量物質常用競爭法，其標準曲線中吸光度與受檢物質的濃度呈負相關。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標準曲線注意圖中橫座標為對數關係，這更有利於測定系統的表達。

（1）漏加底物成分、底物失效、底物配製濃度計算錯誤；

（2）整個ELISA過程中存在抗原或抗體不匹配；

（3）整個ELISA過程中樣品稀釋過度；

（4）稀釋體系錯誤，如使用含蛋白質成分的試劑進行包被。

（1）酶標抗原或抗體濃度過高，嘗試降低濃度；

（2）使用的封閉試劑不正確，或者未封閉；

（3）酶標抗原或抗體與體系中其他試劑有結合；

（4）底物被酶標抗原或抗體污染。

（1）酶標板質量問題，重新檢測酶標板均一性；

（2）包被或加樣過程中有部分孔漏加、少加等情況，可能是操作者不細心，也可能是移液器漏氣；

（3）加樣時移液器打入太多氣泡；

（4）選購的酶標板不正確，可能誤選其他用途的板子；

（5）温育過程中板子疊放過厚；

（6）加樣或稀釋過程中試劑沒有充分混勻，或稀釋梯度計算錯誤；

（7）洗板失誤，部分孔未加洗滌液或洗滌液加入去垢劑後未充分混勻，或洗滌過程中帶入氣泡。

（1）酶標抗原或抗體濃度過高；

（2）某一試劑濃度過高。

（1）酶標抗原或抗體濃度過底，或者標記效率低，或者標記後免疫活性受影響；

（2）試劑被污染，如HRP酶標記的抗原或抗體被疊氮鈉污染；

（3）反應温度過低；

（4）底物緩衝液pH不正確。

（1）酶標抗原或抗體濃度過高；

（2）抗體的非特異性結合；

（3）抗原或抗體不純；

（4）二抗的種屬交叉識別。 ^[2]