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蛋白質印跡法
鎖定
- 中文名
- 蛋白質印跡法
- 外文名
- Western Blot
- 發明者
- Harry Towbin
- 類似方法1
- Southern Blot雜交方法
- 類似方法2
- Northern Blot雜交方法
- 使用材料
- 聚丙烯酰氨凝膠電泳
蛋白質印跡法原理
與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似,但Western Blot法採用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。
蛋白質印跡法分類
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種:
i. 放射自顯影
ii. 底物化學發光ECL
iii. 底物熒光ECF
iv. 底物DAB呈色
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實驗條件的是用第一種方法,發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行,操作也比較簡單,原理如下(二抗用HRP標記):反應底物為過氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。
蛋白質印跡法操作步驟
蛋白質印跡法試劑準備
1、SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。
4、0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。
6、顯色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H202 1.0μl。
蛋白質印跡法樣品製備
(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100mM),搖勻置於冰上。(PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。)
(4)每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液,於冰上裂解30min,為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
(6)於4℃下12000rpm離心5min(提前開離心機預冷)。
(7)將離心後的上清分裝轉移到0.5ml的離心管中放於-20℃保存。
2、組織中總蛋白的提取:
(1)將少量組織塊置於1~2ml勻漿器中球狀部位,用乾淨的剪刀將組織塊儘量剪碎。
(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)於勻漿器中,進行勻漿。然後置於冰上。
(3)幾分鐘後再碾一會兒再置於冰上,要重複碾幾次使組織儘量碾碎。
(4)裂解30 min後,即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中,然後在4℃下12000rpm離心5min,取上清分裝於0.5ml離心管中並置於-20℃保存。
3、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取:
由於受藥物的影響,一些細胞脱落下來,所以除按(一)操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取:
(1)將培養液倒至15ml離心管中,於2500rpm離心5min。
(2)棄上清,加入4ml PBS並用槍輕輕吹打洗滌,然後2500rpm離心5min。棄上清後用PBS重複洗滌一次。
(3)用槍洗幹上清後,加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
(4)將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min,取上清分裝於0.5ml離心管中並置於-20℃保存。
蛋白質印跡法含量測定
1、製作標準曲線
(1 )從-20℃取出1mg/ml BSA,室温融化後,備用。
(2) 取18個1.5ml離心管,3個一組,分別標記為0μg,2.5μg,5.0μg,10.0μg,20.0μg,40.0μg。
(3 )按下表在各管中加入各種試劑。
0μg | 2.5μg | 5.0μg | 10.0μg | 20.0μg | 40.0μg | |
1mg/ml BSA | - | 2.5μl | 5.0μl | 10.0μl | 20.0μl | 40.0μl |
0.15mol/L NaCl | 100μl | 97.5μl | 95.0μl | 90.0μl | 80.0μl | 60.0μl |
G250考馬斯亮藍溶液 | 1ml | 1ml | 1ml | 1ml | 1ml | 1ml |
2、檢測樣品蛋白含量
(1)取足量的1.5ml離心管,每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室温放置30min後即可用於測蛋白。
注意:每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次,無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測,這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是5ul樣品含的蛋白量。
SDS-PAGE電泳
1、清洗玻璃板
2、灌膠與上樣
(1)玻璃板對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上準備灌膠(操作時要使兩玻璃對齊,以免漏膠)。
(2) 按前面方法配10%分離膠,加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。灌膠時,可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然後膠上加一層水,液封後的膠凝的更快。(灌膠時開始可快一些,膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢,否則膠會被衝變型。)
(3 )當水和膠之間有一條折射線時,説明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水並用吸水紙將水吸乾。
(4 )按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。將剩餘空間灌滿濃縮膠然後將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由於膠凝固時體積會收縮減小,從而使加樣孔的上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固後,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
(6) 測完蛋白含量後,計算含50ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中,加入5×SDS上樣緩衝液至終濃度為1×(上樣總體積一般不超過15μl,加樣孔的最大限度可加20μl樣品)。上樣前要將樣品於沸水中煮5min使蛋白變性。
(7)加足夠的電泳液後開始準備上樣(電泳液至少要漫過內測的小玻璃板)。用微量進樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品衝出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時,進樣器需在外槽電泳緩衝液中洗滌3次,以免交叉污染。
3、電泳
電泳時間一般4~5h,電壓為40V較好,也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進行轉膜。
1、轉一張膜需準備6張7.0~8.3cm的濾紙和1張7.3~8.6cm的NC膜或PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套,因為手上的蛋白會污染膜。將切好的NC膜或PVDF膜置於水上浸2h才可使用。用鑷子捏住膜的一邊輕輕置於有超純水的平皿裏,要使膜浮於水上,只有下層才與水接觸。這樣由於毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水裏,膜與水之間形成一層空氣膜,這樣會阻止膜吸水。在加有轉移液的搪瓷盤裏放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。
2、將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,用玻棒來回擀幾遍以擀走裏面的氣泡(一手擀另一手要壓住墊子使其不能隨便移動)。在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊於墊子上),一手固定濾紙一手用玻棒擀去其中的氣泡。
3、要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的反覆撬。撬一會兒玻璃板便開始鬆動,直到撬去玻板(撬時一定要小心,玻板很易裂)。除去小玻璃板後,將濃縮膠輕輕颳去(濃縮膠影響操作),要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋於濾紙上,用手調整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒擀去氣泡。將膜蓋於膠上,要蓋滿整個膠(膜蓋下後不可再移動)併除氣泡。在膜上蓋3張濾紙併除去氣泡。最後蓋上另一個海綿墊,擀幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行,要不斷的擀去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸後會發生短路(轉移液含甲醇,操作時要戴手套,實驗室要開門以使空氣流通)。
5、轉完後將膜用1×麗春紅染液染5min(於脱色搖牀上搖)。然後用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾乾備用。
蛋白質印跡法免疫反應
1、將膜用TBS從下向上浸濕後,移至含有封閉液的平皿中,室温下脱色搖牀上搖動封閉1h。
2、將一抗用TBST稀釋至適當濃度(在1.5ml離心管中);撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪於實驗枱面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液後,將膜蛋白面朝下放於抗體液麪上,掀動膜四角以趕出殘留氣泡;室温下孵育1~2h後,用TBST在室温下脱色搖牀上洗兩次,每次10min;再用TBS洗一次,10min。
蛋白質印跡法化學發光
2、在暗室中,將1×顯影液和定影液分別倒入塑料盤中;在紅燈下取出X-光片,用切紙刀剪裁適當大小(比膜的長和寬均需大1cm);打開X-光片夾,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移動,關上X-光片夾,開始計時;根據信號的強弱適當調整曝光時間,一般為1min或5min,也可選擇不同時間多次壓片,以達最佳效果;曝光完成後,打開X-光片夾,取出X-光片,迅速浸入顯影液中顯影,待出現明顯條帶後,即刻終止顯影。顯影時間一般為1~2min(20~25℃),温度過低時(低於16℃)需適當延長顯影時間;顯影結束後,馬上把X-光片浸入定影液中,定影時間一般為5~10min,以膠片透明為止;用自來水衝去殘留的定影液後,室温下晾乾。
應注意的是:顯影和定影需移動膠片時,儘量拿膠片一角,手指甲不要劃傷膠片,否則會對結果產生影響。
蛋白質印跡法凝膠圖象分析
蛋白質印跡法結果分析
可能出現的問題如下。
1.背景過高
①封閉不充分,應更換封閉液或延長封閉時間;
②抗體濃度過高,應適當增加抗體稀釋倍數;
③洗膜不充分,應增加洗滌次數或洗滌時間;
可能原因 | 驗證或解決辦法 |
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膜沒有完全均勻濕透 | 使用100%甲醇浸膜5~10min |
洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數 |
阻斷不充分 | 增加封閉液孵育時間,或者提高温度選擇合適的封閉試劑(脱脂奶粉、酪蛋白等) |
二抗濃度過高 | 降低二抗濃度 |
檢測過程中膜乾燥 | 保證充分的反應液,避免出現幹膜現象 |
曝光過度 | 縮短曝光時間 |
抗體與阻斷蛋白有交叉反應 |
2.沒有陽性條帶或條帶很弱
①目的蛋白質未充分轉移到膜上或洗膜過度,應使用麗春紅S染色以檢查轉膜效果,或減少洗膜次數,縮短洗膜時間;
③抗體濃度低,應適當增加抗體濃度,或延長孵育時間;
④樣品中的目的蛋白質含量低或沒有目的蛋白質,應增加上樣量;
可能原因 | 驗證或解決辦法 |
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抗體結合不充分 | 增加抗體濃度,延長孵育時間 |
酶失活 | 直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則説明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 |
標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設置陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 |
試劑不匹配 | 一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性 |
一抗失效 | 選擇在有效期內的抗體;並選擇現配現用的工作液 |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 |
膜沒有完全均勻濕透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
靶蛋白分子質量小於10kD | 選擇小孔徑的膜,縮短轉移時間 |
轉移時間不夠 | 對於厚的膠以及高分子量蛋白質需要延長轉移時間 |
抗體活性降低 | 選擇在有效期內的抗體,工作液現配現用,避免長時間放置 |
封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間;換用不同封閉劑類型 |
曝光時間過短 |
3.非特異性條帶多或位置不準確
③抗體濃度過高,應適當稀釋抗體;
可能原因 | 驗證或解決辦法 |
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二抗的非特異性結合 | 增加一個對照:不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否有二抗系統來源。選擇其他二抗(特異性更強的,只針對重鏈的) |
一抗的特異性不夠 | 使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性 |
蛋白質降解 | 使用新鮮製備的標本,並使用蛋白酶抑制劑 |
二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質變性過程及強度 |
抗體濃度過高 | 降低抗體(一抗、二抗)濃度,可以減少非特異性條帶 |
蛋白質上樣量過大 | 降低上樣量 |
封閉劑中有聚集體 | 使用前過濾封閉試劑 |
HRP耦聯二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑,去除聚集體 |
HRP含量過高 |
問題 | 原因 | 解決方案 |
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膠不平 | 玻璃板不乾淨 | 膠板洗刷乾淨; |
催化劑或加速劑的量不合適 | 加入過硫酸銨和TEMED的量要合適; | |
試劑未混均,致使部分膠塊聚合不均勻 | 加入試劑後搖勻,使其充分混合; | |
受熱不均勻導致膠聚合不均勻 | 温度合適 | |
凝膠漏液 | 玻璃板未對齊 | 兩塊玻璃板底部要對齊 |
條帶比正常的窄 | 凝膠聚合不均勻 | 灌膠時候儘量混合均勻,動作輕緩; |
加樣孔扭曲 | 拔梳子要迅速,清洗加樣孔要小心,以免把上樣帶扭曲 | |
“微笑”條帶 | 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一 | 純化樣品,調整鹽濃度 |
“倒微笑”條帶 | 膠板底部有氣泡會影響電泳效果 | 應趕走膠板底部氣泡,同時注意電泳槽裝置是否合適 |
凝膠腫脹或捲曲 | 取出凝膠後暴露空氣中過久 | 可將凝膠在轉膜之前放到轉膜緩衝液中浸泡5~10min |
條帶歪斜或漂移 | 電轉儀長期使用導致海綿變薄,“三明治”結構不緊湊導致 | 可在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙 |
單個或多個白點 | 膜與膠塊之間有氣泡 | 確保膜和膠塊之間沒有氣泡 |
轉膜緩衝液過熱 | 緩衝液中離子濃度太低,電流或電壓太高 | 轉膜過程注意降温 |
背景過高 | 膜沒有均勻浸濕 | 轉膜前用100%甲醇將膜完全浸濕 |
膜或者緩衝液污染 | 拿取膜與吸水紙時要戴手套 | |
封閉不充分 | 更換新鮮轉膜緩衝液 | |
抗體與封閉劑出現交叉反應 | 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應 | |
抗體濃度過高 | 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度 | |
封閉時間與清洗時間過長 | 減少封閉或清洗時間 | |
上樣量過大 | 合適的上樣量 | |
壓片時間過長 |
蛋白質印跡法其他信息
值得一提的是,Western Blot這個名稱的由來很有意思。最開始做印跡工作的是一個叫做Edwin Southern的科學家,但印跡的對象是DNA鏈,他把這種技術稱為Southern Blot。後來出現了兩個過程相似,但是對象不同的印跡方法,一個針對RNA,一個針對蛋白質,人們把這兩種技術分別稱為Northern Blot(由斯坦福大學的George Stark發明)和Western Blot。這兩個技術的命名與發明人的名字沒有關係了。