動物乳腺生物反應器

乳腺生物反應器生產的外源蛋白種類廣泛，從小分子肽到大分子複雜蛋白質，從生物活性酶到抗體、病毒抗原蛋白均可有效生產。利用動物乳腺生物反應器生產重組蛋白的優點有：（1）生物活性高，無污染。動物乳腺有完整的蛋白質翻譯後修飾系統，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，從而保證了產品的高生物活性。（2）易分離提純，成本低廉；現有的一些人藥物蛋白之所以昂貴，除了原料難以收集外，另一原因是分離提純極為困難成本極高。而動物乳腺生物反應器的產物直接經乳汁分泌出體外，只需用常規方法除去酪蛋白沉澱乳清，再經層析即可得到重組蛋白，已經建立起完整的分離純化生產程序。（3）產量高。外源基因在動物乳腺中的表達量可以達到每升幾克到幾十克，小羣轉基因大家畜的產量即可滿足全世界市場的需求。動物乳腺生物反應器已經成為生物技術領域最具開發應用前景的尖端方向。

轉基因動物的研究始於20世紀80年代初。1980年，Gordon等將重組DNA用顯微注射法導入小鼠受精卵原核，首次獲得了整合有外源基因的小鼠。1982年，Palmiter等將大鼠生長激素基因顯微注射到小鼠受精卵中，首次獲得了體重為正常小鼠2 倍以上的“超級小鼠”並提出了從轉基因動物中提取藥物蛋白的設想。此後幾年的許多研究奠定了轉基因動物技術體系的基礎，但真正的乳腺生物反應器研究則始於1987 年Gordon 等的工作，他們將組織型纖溶酶原激活劑（tPA）與小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的啓動子構成重組基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表達tPA 的轉基因小鼠，同年，世界上第一隻能從乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的轉基因綿羊在英國羅斯林研究所誕生。從此，開始了乳腺生物反應器的實用性研究。

Simons等（Simons等，1987年）將帶MT啓動子的β-乳球蛋白-凝血因子IX（BLG-FIX）、BLG-AAT 等重組DNA片段注射到綿羊受精卵中，獲得了在乳汁中有外源基因表達的轉基因後代。Wilmut等將羊乳球蛋白基因片段與F-IX和AAT-cDNA 融合質粒注入小鼠及綿羊受精卵中，獲得乳汁中含F-IX 和AAT 的轉基因小鼠及綿羊。Wright等將綿羊BLG基因調控區與人AAT基因相連，獲得了 4 只轉基因綿羊。Velander 等利用WAP 基因啓動子與人蛋白質C（hPC）cDNA 重組基因獲得的轉基因豬，重組hPC的表達量（1g/L）比人血中hPC　濃度還高200倍。Ebert等用β-CA基因的啓動子引導tPA在山羊乳汁中得到表達（1-3g/L）。Wilmut等（Wilmut等，1997年）首創體細胞克隆技術併成功構建了表達人F-IX的轉基因克隆綿羊。2000年，英國PPL 公司將人類AAT 基因定點整合到胎兒成纖維細胞的前膠原基因座，用轉基因細胞生產的轉基因打靶綿羊（McCreath等；2000年）；2001年，他們又利用基因打靶技術生產出了AAT、3-GT 和朊病毒雙剔除的克隆綿羊。上述研究可以看出，乳腺生物反應器研究從模式動物——小鼠的轉基因開始，逐步建立起了大動物乳腺生物反應器製備的技術平台。

我國的施履吉院士在20世紀80年代初就提出了乳腺生物反應器的構想並獲得了表達乙肝病毒表面抗原的轉基因兔。1996 年10 月，復旦大學遺傳所和上海醫學遺傳所合作成功地獲得了表達有活性的F-IX蛋白的轉基因小鼠和5只轉基因綿羊，真正開始了我國的乳腺反應器構建工作。1998年，上海醫學遺傳研究所構建成以牛酪蛋白基因啓動子驅動F-IX基因表達的表達載體，顯微注射到山羊受精卵的雄原核，成功製備了5頭轉基因羊。上海醫學遺傳研究所於1999年2月，得到一頭帶有人血清白蛋白基因的轉基因牛。2000年，中國農大和北京興源生物科技中心合作，將改造的人AAT 基因顯微注射到山羊受精卵原核中，獲得了3只帶有人AAT 的轉基因山羊。2005年青島森淼公司與中科院遺傳與發育生物學研究所等科研院所聯合開展，選用嶗山奶山羊完成了人的乙肝表面抗原、抗凝血酶AT-Ⅲ、人β-干擾素等三種轉基因載體的構建，並完成了羊胎兒成纖維細胞株的建立，應用細胞核移植技術成功獲得了克隆奶山羊。成功報道仍限於顯微注射等常規方法，離國外尚有一定差距。

製備乳腺生物反應器的關鍵是保證目的蛋白特異性在乳腺中的高效表達，傳統表達載體都是選用某種乳蛋白基因的調控序列作為啓動子元件。已經克隆並用作構建載體的乳蛋白基因主要有β-乳球蛋白（BLG）基因、aS1-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清白蛋白基因。

十多年來，已有數種高價值的產品在大動物乳汁中生產出來，於小鼠乳腺中獲得表達的產品更是多達數百種。從國際大公司開發的情況可以看出，高經濟價值的醫用蛋白和營養蛋白是重要的研發對象，如AT一Ⅲ、AAT、蛋白C、乳鐵蛋白、乳糖酶等都已進入了三期或二期臨牀試驗階段。選擇目的基因應當首先考慮那些正常情況下來源困難或濃度低，其他表達系統難以生產且I臨牀應用前景廣闊的蛋白基因。可以預見，由於細胞工程和基因治療技術的發展，細胞因子類產品將不會通過動物乳腺反應器生產，而用途更廣、需求量更大的治療性抗體、營養蛋白和工程酶將成為製備乳腺生物反應器的首選靶蛋白。另外，若能建立起穩定的轉基因家畜羣，以乳腺反應器生產基因工程疫苗，不僅生產效率可觀，而且可直接以乳汁進行臨牀免疫，達到方便快捷的目的。

現有的應用於動物乳腺生物反應器製備的轉基因技術主要有：

1 顯微注射法

2 逆轉錄病毒介導法

3 配子介導法

4 胚胎幹細胞（ES）介導法

5 核移植介導法

還有利用同源重組原理髮展起來的基因打靶（敲除）技術，結合體細胞克隆，正成為動物乳腺生物反應器製備的新研究熱點。

在乳腺反應器研製中尚存在下述待解決的難題：（1）轉基因動物的成功率低。（2）目的蛋白的表達水平遠低於乳汁中總蛋白含量。（3）目的基因的分離、改造、載體構建、體細胞克隆等技術環節還不夠成熟。（4）“位置效應”與“劑量效應”無法克服。（5）乳汁蛋白基因表達調控機理、目的基因在宿主染色體上整合的詳細機制、基因表達調控元件在不同家畜表現差異的原因、乳腺細胞對蛋白質的加工修飾機理等還未弄清。（6）產品的安全性的問題，外源基因侵入對動物和基因藥物對人體正常功能有何影響，否會造成基因污染，尚難定論。

雖有這些問題存在，但許多國家政府和大型製藥企業仍競相投入巨資資助乳腺生物反應器產品的開發和生產，使乳腺反應器研製和產業化呈現日益加速的趨勢。利用乳腺反應器生產營養活性蛋白，如需求量極大的護膚品中的活性蛋白，或者改造奶質而使其具備營養和藥用雙重功能，或者直接生產口服生物製品，都具有極大的市場潛力。我們相信乳腺生物反應器產業不僅會成為有高額利潤回報的新型行業，而且將會帶動整個國民經濟的發展，形成全新的產業結構模式。因此，我們應當抓住機遇，增加投資力度，大力興辦乳腺反應器產業，以在未來的生物高技術競爭中奪得主動權。