外源基因導入

外源基因導入是基因工程的一個關鍵步驟。外源基因導入需要合適的載體、酶、和方法。

外源基因導入的方法很多，但同一個方法不能適用於所有的生物體。

外源基因導入是基因工程或轉基因工程的一個關鍵步驟。是指通過現代遺傳工程技術將來自於不同生物體的基因導入受體生物基因組的過程。

外源基因導入是增加生物體遺傳多樣性、創造新品種和新性狀的重要途徑和方法。外源基因導入也是研究基因功能必不可少的技術手段。

真核細胞基因主要通過人工合成獲得：一是以mRNA為模板，逆轉錄成互補的單鏈DNA，然後在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因；二是以已知蛋白質的氨基酸序列推測出相應的 mRNA序列和結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法以單核苷酸為原料合成 ^[1]  。

常用的載體是質粒。利用同樣限制性內切酶切斷外源基因和質粒，並在DNA連接酶作用下，將質粒與外源基因結合形成一個重組DNA分子 ^[1]  。

通過載體把外源基因帶入生物體內，並使它得到表達 ^[1]  。常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、動植物細胞等。外源基因導入受體細胞後，就可以隨着受體細胞的繁殖而複製。

在全部受體細胞中，真正能夠攝入外源基因的受體細胞是很少的。因此，必須通過一定的手段對細胞中是否導入了外源基因進行檢測 ^[1]  。檢測的方法有很多種，比如抗性篩選。

外源基因導入宿主細胞的方法很多。在植物和微生物生物技術中，外源基因導入到寄主細胞的過程也稱為轉化；在動物生物技術中，該過程被稱為轉染。

對於某些細菌，不需要外部方法來引入基因，因為它們天然能夠吸收外源DNA ^[2]  。大多數物種的細胞對外源基因是有阻隔作用的，因此，需要某種干預增加細胞膜通透性，允許DNA通過，並允許DNA穩定地插入宿主基因組中。

基於化學的外源基因導入方法依賴於使用天然或合成的化合物形成促進基因導入的顆粒。這些物質能夠靜電結合到DNA或RNA並將它們進行壓縮，所以可適應較大的外源基因的導入 ^[3]  。化學載體通常通過內吞作用進入細胞，可以保護外源基因免於降解 ^[4]  。

最簡單的導入方法之一是給細胞一個熱衝擊來改變細胞環境。熱激前，將細胞保存在冷的含有二價陽離子（通常為氯化鈣）的溶液中温育。氯化鈣能部分破壞細胞膜，使外源DNA進入宿主細胞。

另一種簡單的方法涉及使用磷酸鈣來結合DNA，然後將其暴露於培養細胞。溶液與DNA一起被細胞包圍，少量的DNA可以整合到基因組中。

脂質體和聚合物可用作載體將DNA導入到細胞中。帶正電荷的脂質體與帶負電荷的DNA結合，而聚合物可以設計成與DNA相互作用。它們分別形成脂質複合物和複合物，然後被細胞攝取。

使用工程改造過的無機和有機納米粒子是一種非病毒的實現外源基因導入的方法 ^[5]  。

物理方法就是通過外力將遺傳物質引入導入細胞的方法。

用10-20kV / cm的電場短暫地衝擊細胞，在細胞膜上產生小孔，質粒DNA可以通過該孔進入。電擊後，小孔通過細胞的膜修復機制迅速關閉。

使用生物射彈將DNA插入植物細胞的另一種轉化方法。其中金或鎢的顆粒被DNA包覆，然後射入幼苗或植物胚胎 ^[6]  。該方法可用於對土壤桿菌感染不敏感的植物，也可以用於植物質體的轉化。植物細胞也可以使用電穿孔進行轉化。由於對細胞和DNA造成的損害，生物射彈和電穿孔的轉化效率低於農桿菌轉化 ^[7]  。

將DNA通過細胞核包膜直接注入細胞核的地方。這是動物轉基因應用較多的技術。

使用聲波在細胞膜中產生孔隙以允許遺傳物質進入。

用激光脈衝在細胞膜中產生孔以允許遺傳物質進入。

磁轉使用與DNA複合的磁性顆粒和外部磁場濃縮核酸顆粒進入靶細胞。

利用農桿菌T-DNA序列，允許遺傳物質自然插入植物細胞 ^[8]  。質粒T-DNA隨機整合到宿主細胞的基因組中 ^[9]  。通過修改質粒以表達目的基因，可以將選擇的目的基因穩定地插入植物基因組中。 T-DNA唯一重要的部分是它的兩個小的（25個鹼基對）邊界重複序列，其中至少有一個是植物轉化所必需的。另一種方法是農桿菌滲入 ^[10]  。

病毒介導的外源基因導入是利用病毒將其DNA注入宿主細胞內的能力以及病毒自身複製能力將外源基因導入的方法。病毒轉化方法更易誘導免疫反應，但具有高效率 ^[4]  。然而，病毒只能將非常小的DNA片段輸送到細胞中，費力、插入位點隨機，存在細胞質效應和誘變的風險 ^[11]  。

基因療法利用外源基因導入來治療細胞疾病或病症，利用能夠產生細胞特異性的非免疫原性載體提供足夠量的轉基因表達以產生所需效果 ^[12]  。

外源基因導入應用最廣泛的領域是轉基因生物新品種的培育。以轉基因植物為例，2016年，全球範圍轉基因栽培面積達到1.9億公頃 ^[13]  。