激光掃描共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscope）是20世紀80年代中期發展起來並得到廣泛應用的新技術 ^[1]  ，它是激光、電子攝像和計算機圖像處理等現代高科技手段滲透，並與傳統的光學顯微鏡結合產生的先進的細胞分子生物學分析儀器，在生物及醫學等領域的應用越來越廣泛，已經成為生物醫學實驗研究的必備工具 ^[2]  。

傳統熒光顯微鏡使用熒光物質標誌細胞中的特定結構，不僅圖像與背景的對比度增強，而且由於許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辨率(δ=0.61·λ/NA，其中δ為顯微鏡的分辨率；λ為照明光線的波長；NA 為物鏡的數值孔徑)。但當所觀察的熒光標本稍厚時，傳統熒光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現出來：焦平面以外的熒光結構模糊、發虛。原因是大多數生物學標本是層次區別的重疊結構(如耳蝸基底膜。其實是外毛細胞 、多種支持細胞 、神經纖維等組成的空間結構),，在普通光學顯微鏡下聚焦平面的變化， 會表現出不同的形態。假若熒光標記的結構在不同層次上都有分佈，且重疊在一起，反射熒光顯微鏡(epifluorescent microscope)不僅從焦平面上收集光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡所接收，熒光顯微鏡的光學分辨率就要大大降低 。

在傳統光學顯微鏡基礎上，激光掃描共聚焦顯微鏡用激光作為光源，採用共軛聚焦原理和裝置，並利用計算機對所觀察的對象進行數字圖像處理觀察、分析和輸出。 其特點是可以對樣品進行斷層掃描和成像，進行無損傷觀察和分析細胞的三維空間結構[3]。 同時，利用免疫熒光標記和離子熒光標記探針，該技術不僅可觀察固定的細胞、組織切片,還可以對活細胞的結構、分子、離子及生命活動進行實時動態觀察和檢測，在亞細胞水平上觀察諸如 Ca²⁺，pH 值，膜電位等生理信號及細胞形態的變化，成為形態學、分子細胞生物學、神經科學、藥理學、遺傳學等領域中新一代強有力的研究工具 ^[3]  ，極大地豐富了人們對細胞生命現象的認識。

激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲於計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。

在結構 ^[4]  配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學顯微鏡的基本構造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統 (包括數據採集、處理、轉換、應用軟件)、圖像輸出設備、光學裝置和共聚焦系統等部分 [2]。由於該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學切片”（Optical sectioning）、三維重建、動態分析等優點，因而為基礎醫學與臨牀醫學的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對熒光樣品的觀察具有明顯的優勢，只要能用熒光探針進行標記的樣品就可用其觀察。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用於觀察細胞形態，也可以用於細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量, 配合焦點穩定系統可以實現長時間活細胞動態觀察。

在普通寬視野光學顯微鏡中，整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察 ^[5]  。 同時，來自焦點以外的其他區域的熒光對結構的干擾較大，尤其是標本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。

激光共聚焦顯微鏡脱離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，採用激光束作光源，激光束經照明針孔，經由分光鏡反射至物鏡，並聚焦於樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。 組織樣品中如果有可被激發的熒光物質，受到激發後發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦後的光被光電倍增管（PMT）探測收集，並將信號輸送到計算機，處理後在計算機顯示器上顯示圖像 ^[6]  。 在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由於照明針孔與探測針孔相對於物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦於照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦[7]。 以激光作光源並對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。

激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）是近代最先進的細胞生物醫學分析儀器之一。它是在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激光熒光探針，利用計算機進行圖像處理，不僅可觀察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞的結構、分子、離子進行實時動態地觀察和檢測。激光掃描共聚焦顯微技術已用於細胞形態定位、立體結構重組、動態變化過程等研究，並提供定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究手段，結合其他相關生物技術，在形態學、生理學、免疫學、遺傳學等分子細胞生物學領域 ^[7]  得到廣泛應用。

激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標本以單波長、雙波長或多波長模式，對單標記或多標記的細胞及組織標本的共聚焦熒光進行數據採集和定量分析,同時還可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加， 形成組織或細胞中熒光標記結構的總體圖像,以顯示熒光在形態結構上的精確定位。 常用於原位分子雜交、腫瘤細胞凋亡觀察、單個活細胞水平的 DNA 損傷及修復等定量分析。

動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通信在細胞增殖和分化中起着重要作用。 激光掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細胞縫隙連接分子的轉移來測量傳遞細胞調控信息的一些離子、小分子物質。 該技術可以用於研究胚胎發生、生殖發育、神經生物學、腫瘤發生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用，也可用於鑑別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學物質。

細胞物理化學測定

激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞形狀、周長、面積、平均熒光強度及細胞內顆粒數等參數進行自動測定。 能對細胞的溶酶體、線粒體、內質網、細胞骨架、結構性蛋白質、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞內特異結構的含量、組分及分佈進行定量、定性、定時及定位測定。

細胞內鈣離子和 pH 值動態分析

激光掃描共聚焦顯微鏡技術是測量若干種離子濃度並顯示其分佈的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分佈成為可能。 利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個細胞內 pH 和多種離子(Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺)在活細胞內的濃度及變化。 一般來説，電生理記錄裝置加攝像技術檢測細胞內離子量變化的速度相對較快,但其圖像本身的價值較低,而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態變化的圖像,這對於研究鈣等離子細胞內動力學有意義。

三維圖像的重建

傳統的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過對同一樣品不同層面的實時掃描成像，進行圖像疊加可構成樣品的三維結構圖像。 它的優點是可以對樣品的立體結構分析，能十分靈活、直觀地進行形態學觀察,並揭示亞細胞結構的空間關係。

該方法的原理是一個細胞內的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發光能力，而鄰近未被漂白細胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴散到已被漂白的細胞中，熒光可逐漸恢復。 可通過觀察已發生熒光漂白細胞其熒光恢復過程的變化量來分析細胞內蛋白質運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。

活細胞觀察通常需要一定的加熱裝置及灌注室，以保持培養液的適宜温度及 CO₂ 濃度的恆定。 激光掃描共聚焦顯微鏡，其光子產生效率已大大改善，與更亮的物鏡和更小光毒性的染料結合後可以減小每次掃描時激光束對細胞的損傷,用於數小時的長時程定時掃描,記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象。

在細胞及分子生物學基礎研究中的應用

激光掃描共聚焦顯微鏡應用照明針與檢測孔共軛成像，有效抑制了焦外模糊成像並可對標本各層分別成像，對活細胞行無損傷的“光學切片”這種功能也被形象的稱為“顯微 CT”。CLSM 還可以對貼壁的單個細胞或細胞羣的胞內、胞外熒光作定位、定性、定量及實時分析，並對胞內成分如線粒體、內質網、高爾基體、DNA、RNA、Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺ 等的分佈、含量等進行測定及動態觀察，使細胞結構和功能方面的研究達到分子水平。

在腫瘤和抗癌藥物篩選研究中的應用

普通顯微鏡及電子顯微鏡，僅能對腫瘤相關抗原進行定性分析，而 CLSM 則可對單標記或者多標記細胞、組織標本及活細胞進行重複性極佳的熒光定量分析，從而對腫瘤細胞的抗原表達、細胞結構特徵，抗腫瘤藥物的作用及機制等方面定量化 ^[8-9]  。

在血液病學和醫學免疫學研究中的應用

激光掃描共聚焦顯微鏡觀察免疫細胞和系統，如樹突狀細胞、單核-吞噬細胞系統、自然殺傷細胞、淋巴細胞時，在準確細胞定位的同時有效鑑定免疫細胞的性質。

激光掃描共聚焦顯微鏡分層掃描發現神經軸突的內部結構連續性好。用激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察到腦幹組織中神經軸突的正常走向，可排除在熒光顯微鏡下由此造成的一些病理假象 ^[10]  。並且激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察神經軸突的三維結構，因此應用 CLSM 有可能觀察到普通光鏡下未能發現的神經組織的細微病變[11]。

在眼科研究中的應用

利用激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察晶狀體，角膜、視網膜、虹膜和睫狀體的結構和病理變化[12]。

激光掃描共聚焦顯微鏡在骨科研究領域的應用現狀表明，CLSM在觀測骨細胞形態學研究、骨細胞特異性蛋白（骨鈣素）以及骨細胞之間的相互作用具有顯著的優勢。

激光掃描共聚焦顯微鏡作為一項全新的實驗手段和強有力的研究工具，為我們解決一些以往研究工作中不能解決的技術難題創造了條件，因而必將得到更為廣泛的應用。隨着新軟件的不斷開發及各個學科 ^[11-12]  的不斷髮展和相互滲透，相信它還將會有更廣闊的發展前景。