免疫熒光標記

免疫熒光標記技術始創於20世紀40年 ^[1]  代初，1942年Coons等首次報道用異氰酸熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。當時由於異氰酸熒光素標記物的性能較差，未能推廣使用。直至1958年Riggs等合成了性能較為優良的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）。Marshall等又對熒光抗體標記的方法進行了改進，從而使免疫熒光技術逐漸推廣應用。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素和四甲基異氰酸羅達明。

根據抗原抗體反應的結合步聚的不同，免疫熒光標記技術可分為直接法、間接法、補體法和雙重免疫熒光法四種。直接法是將熒光素標記的特異性抗體直接與相應的抗原結合，以檢查出相應的抗原成分。間接法是先用特異性抗體與相應的抗原結合，洗去未結合的抗體，再用熒光素標記的抗特異性抗體（間接熒光抗體）與特異性抗體相結合，形成抗原一特異性抗體一間接熒光抗體的複合物。因為在形成的複合物上帶有比直接法更多的熒光抗體，所以間接法要比直接法更靈敏一些。補體法是用特異性的抗體和補體的混合液與標本上的抗原反應，補體就結合在抗原抗體複合物上，再用抗補體的熒光抗體與之相結合，就形成了抗原一抗體一補體一抗補體熒光抗體的複合物。熒光顯微鏡下所見到的發出熒光的部分即是抗原所在的部位。補體法靈敏度高，適用於各種不同種屬來源的特異性抗體的標記顯示。在對同一組織細胞標本上需要檢測兩種抗原時，可進行雙重熒光染色，即將兩種特異性抗體（例如抗A和抗B）分別以發出不同顏色的熒光素進行標記，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記發出黃綠色熒光，抗B抗體用四甲基異硫氰酸羅明達標記發出橙紅色熒光，將兩將熒光抗體按適當比例混合後，加在標本上（直接法）就分別形成抗原抗體複合物，發出黃綠色熒光的即抗A抗體結合部位，發出橙紅色熒光的即抗B抗體結合的部位，這樣就明確顯示出兩種抗原的位置。

半個多世紀以來，經過許多學者不斷改進和發展，使此項技術成為微生物學、免疫學、病理學及免疫組織化學中常用的一種免疫學實驗方法，在臨牀上得到了廣泛的應用，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。