核糖核酸酶P

托馬斯·羅伯特·切赫(Thomas Robert Cech)

1947年生於美國。格里內爾大學畢業後，在加利福尼亞大學的柏克萊分校獲得博士學位。1983年任科羅拉多大學教授。他在研究四膜蟲的rRNA的成熟體結構中，發現了可以自我拼接的RNA的催化作用（核糖核苷酸酶）。1989年獲諾貝爾化學獎。

“如果你是一個不為常識所束縛的人，那麼，你有可能獲諾貝爾獎。

切赫生於芝加哥。大學畢業後，他到美國國家衞生研究院（NIH）工作，主要研究原生動物四膜蟲的核蛋白體核糖核酸（rRNA）基因。

四膜蟲雖然是單細胞，但它又不同於細菌，而是和人一樣的真核生物。對那些想要了解人類的人來説，四膜蟲是一種非常好的實驗材料。

真核生物的基因是由遺傳信息部分和非遺傳信息部分組成的。在兩者都被轉錄成前體mRNA（信使RNA）後，除去非信息部分，成為只含有信息部分的成熟mRNA，最後，在成熟的mRNA基礎上合成蛋白質。rRNA的情況也是如此，基因中包括非信息部分在內，先合成前體rRNA，然後除去非信息部分，成為成熟的rRNA。

切赫的努力目標是找出從前體去除非信息部分並且使前體成為成熟體的那個酶。結果他發現，在含有嘌呤核苷和鎂離子的溶液中，無論加上哪一種蛋白提取液，都能轉變為成熟體。甚至在不添加對照用的標準蛋白提取液的情況下，也能變成成熟的RNA。

試驗樣品與對照樣品如果沒有差別，一般説實驗就失敗了，但是切赫並不認為是失敗，而是坦然地接受了這個結果。他認為，不添加蛋白提取液也能使前體變成成熟體，證明RNA本身具有一種催化能力。

這個結論是對常識的一種否定。通常認為生物體的催化作用是依靠酶來完成的，而酶全部是蛋白質。提出這種理論是需要勇氣的。他發表了論文，宣佈自己發現了一種本身帶有催化作用的RNA，但是沒有人相信他。

後來，奧爾特曼博士通過實驗顯示了使前體tRNA變成成熟體tRNA的酶——核糖核酸酶P的活性是混在RNA中的，蛋白質部分沒有這種活性。有關學會在新的事實面前終於承認了RNA的催化功能。於是，1989年切赫和奧爾特曼一起獲諾貝爾化學獎。

切赫為什麼能發現RNA的催化作用並且獲諾貝爾獎呢。

大概是因為他對自己的實驗很有信心吧，得出與常識完全相反的結果。比起常識，更相信實驗結果。

大多數人在學習了前人發現的法則、原理或者方法論以後，都可以靈活運用，從事研究；然而不知不覺中卻為這些既定的知識和觀念所束縛。他們只在前人圈定的範圍內從事實驗，只在既定知識框架內進行思考。實際上，前人發現的法則、原理或者方法論往往只在某種範圍內通用，這一點務必銘記在心。如果立足於我們人類對自然界的理解只是極為有限的一部分，坦然地接受實驗結果，那麼，我們的想象力就如同插上了可以自由翱翔的翅膀。

發現了用常識解釋不通的、具有酶功能的RNA，獲諾貝爾獎。

西德尼·奧爾特曼(Sidney Altman)

1939年生於加拿大。科羅拉多大學畢業後，在加利福尼亞大學取得博士學位。1980年起任耶魯大學教授。在研究細菌tRNA的合成中，發現RNA具有催化作用，為此，1989年獲諾貝獎。

他出生在加拿大，科羅拉多大學畢業，1971年發現了可以切斷tRNA（轉移核糖核酸）前體的酶——核糖核酸酶P。起初他認為，要顯示核糖核酸酶P在體內的切斷活性是離不開RNA（核糖核酸）成分和蛋白質成分的。

他聽説切赫關於四膜蟲的rRNA（核蛋白體核糖核酸）前體依靠rRNA本身的催化作用變成了成熟體的報告後，馬上更新檢查自己的核糖核酸酶P的RNA成分和蛋白質成分的機能。他想，tRNA和rRNA有區別，但是兩者都是靠酶的催化才從RNA的前體變成成熟體的。

結果，他發現核糖核酸酶P在RNA成分中的正確位置上切斷了前體tRNA，而蛋白質成分中則沒有這種切斷活性。

切赫的rRNA是自身切斷自身，然後進行拼接的分子內的自我催化，還不能絕對説是酶。而核糖核酸酶P催化的不是自己，而是催化別的分子的tRNA，使之成熟，所以應該認為是酶。他發表了RNA具有酶催化作用的論文。

這以後，他又陸續查明，不僅tRNA、rRNA，而且mRNA也是靠RNA的催化作用成為成熟的RNA的。1989年，他和切赫一起獲諾貝爾化學獎。

其實，奧爾特曼1971年就已經分離出有可能獲獎的RNA的酶了，只是連他自己在內，誰都沒有意識到這一點。若與切赫的發現比較，切赫的發現甚至可稱是再發現。像孟德爾等科學家那樣，雖有重大發現但當時得不到社會的承認，日後他人再重新發現的現象時有發生。但是，像這種本人沒有發現其重要性，日後從他人的工作中得到啓發再由本人重新發現的例子卻非常少。

將別人的研究成果當作摹本，重新檢查自己的研究成果，拂去灰塵，獲諾貝爾獎。

應用人胎肝細胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

研究抗組織相容性複合物(MHC)Ⅱ類分子轉錄激活因子(CⅡTA)核糖核酸酶P(RNaseP)抑制肝細胞表面MHCⅡ分子的表達。

方法 ：M1—RNA是RNaseP的催化活性單位，設計並克隆針對CⅡTA第629位點的M1—RNA(M1—629—GS)及其對應的CⅡTA靶序列，分別插入腺相關病毒載體psNAV(psNAV—M1—629—GS)及pGEM—7zf(+)載體(pGEM—629)，進行體外轉錄和切割反應鑑定其活性。通過納米載體介導psNAVM1—629—Gs穩定轉染人胎肝細胞，流式細胞術檢測MHCⅡ類抗原表達，逆轉錄聚合酶鏈反應檢測CⅡTA mRNA水平。

結果 ：M1—629—GS與pGEM—800體外切割產物電泳見預期切割條帶(553nt和176nt)。psNAVM1—629—GS^+肝細胞表面人白細胞抗原(HLA)—DR、DP、DQ的誘導型表達分別為(1．01±0．51)%、(4．37±1．28)%、(1．98±0．42)%，對照組psNAVM1—452—GS^+分別為(10．81±3．09)%、(40．12±2．60)%、(5．71±0．11)%，兩組比較分別下調90．65%、89．11%及65．32%．；psNAV—M1—629—GS^+克隆誘導型CⅡTA mRNA與β—actin比值為0．94±0．25，空載體組比值為2．30±0．49，M1—629—GS可明顯下調CⅡTA mRNA含量(t=5．56，P≤0．01)。

結論 ：抗CⅡTA RNaseP—M1—629—GS可發展為新一代抗肝移植排斥的核酸藥物。

探討抗MHC-Ⅱ類分子轉錄激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P對Daudi細胞表面MHC-Ⅱ類分子表達的抑制作用.

M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性單位.以pTK117質粒為模板,PCR擴增帶有抗CⅡTA第452及629位點的引導序列的M1-RNA(M1-452-GS及M1-629-GS),再分別插入pUC19載體(pUC19-M1-452-GS 和 pUC19-M1-629-GS).從Raji細胞中克隆CⅡTA基因DNA片段(114～800)後插入pGEM-7zf(+)質粒.將重組M1-RNA與靶基因的mRNA進行細胞外共孵育,顯示僅pUC19-M1-629-GS可特異性地切割靶基因mRNA.再將M1-629-GS克隆入psNAV載體(pA629)並穩定轉染Daudi細胞株,RT-PCR檢測其CⅡTA的mRNA水平,流式細胞術檢測其HLA-DR、DP、DQ抗原表達.與對照組比較,M1-629-GS陽性Daudi細胞的CⅡTA mRNA含量減少90.19﹪(P≤0.05),其HLA-DR、DP、DQ抗原表達分別降低91.97﹪、90.19﹪、92.36﹪(P≤0.05).

研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通過抑制CⅡTA的轉錄而降低Daudi細胞表面的MHC-Ⅱ類分子的表達.

探討抗MHCⅡ類分子轉錄激活因子(CⅡTA)的M1-RNA抑制細胞表面MHCⅡ類分子的表達.

M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性單位,設計並克隆針對CⅡTA第3408位點的M1-RNA(M1-3408-GS)及其相應的CⅡTA靶基因片段(3176-3560),分別插入pUC19、pGEM-7zf(+)載體,進行細胞外切割活性篩選.將細胞外切割作用明顯的M1-3408-GS亞克隆入psNAV載體並穩定轉染Jurkat細胞株,採用流式細胞術檢測該細胞表面經典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)類抗原表達,RT-PCR檢測其CⅡTA的mRNA水平.

結果表明:在重組人干擾素(IFN)-γ誘導下,M1-3408-GS陽性Jurkat細胞株與對照組比較,其表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ抗原誘導型表達分別降低了83.17﹪、94.12﹪及84.31﹪;同時CⅡTA的mRNA含量明顯降低(P≤0.05,t=4.89).結論:抗CⅡTA的M1-RNA(M1-3408-GS)降低了自身mRNA含量,從而阻止其調控的MHCⅡ類分子的表達.

來自美國科羅拉多州大學分子，細胞和發育生物學系，以及亞利桑那州立大學生命科學學院化學與生物化學系的研究人員通 過比較真核與細菌核糖核酸酶P RNA（Ribonuclease P RNA，RNase P）的不同，獲得了一RNase P三級結構，為研究RNase P帶來了突破性進展，這一研究成果公佈在新鮮出爐的《Molecular Cell》（11月3日）雜誌封面上。

核糖核酸酶P（RNase P）是負責tRNA前體5'端成熟的酶，它由蛋白質和RNA兩種亞單位組成。1983年Altaman等人報道，在較高濃度的鎂離子和適量精氨酸參與下，RNase P中的 RNA能夠切割tRNA前體5'端。而Rnase P中的蛋白組分沒有催化功能，只是起穩定構象的作用。這是首次報道的具有反式切割作用的RNA分子。由於他們具有類似核糖核酸酶功能，而化學本質為核酸，因此被切赫稱之為核酶。鑑於切赫在此領域作出的巨大貢獻，因而獲得1988年諾貝爾化學獎。

在之後的研究中陸續發現，細菌和真核的RNase P RNA有相同的起源祖先，但是卻沿着不同的進化道路有了分化：真核的RNase P RNA在沒有蛋白的存在的時候是不具有催化功能的，細菌的RNA則相反——沒有蛋白也同樣可以催化底物。

通過比較這兩種不同的RNA，研究人員逐漸清楚瞭解了這個RNA和蛋白結合世界的轉換，他們發現雖然真核生物RNAs不能單獨催化底物，但是即使在沒有蛋白的存在下，也可以摺疊成有功能的形式，並結合到tRNA上去。基於這些交聯反應結果和細菌RNAs的晶體結構，研究人員得到了一種真核RNase P RNA三級結構模型，這種RNA包含一個核心與細菌RNA相似的結構，但是這個結構沒有細菌RNAs催化的特徵和三級結構的穩定性。

申請專利號： CN94112572.6

專利申請日 ：1994.10.19

名稱 ：一種由核糖核酸連續酶水解制5'一核苷酸的方法

公開（公告）號： CN1121112

公開（公告）日： 1996.04.24

類別 ：化學；冶金

申請（專利權）： 中國科學院大連化學物理研究所

地址：116012遼寧省大連市中山路161號

發明（設計）人： 邵晶平; 郭春香; 劉宇新; 郭和天

專利代理機構： 中國科學院瀋陽專利事務所

代理人：張晨

摘要：一種由核糖核酸連續酶水解制5′－核苷酸的方法，其特徵在於：將核酸酶首先注入超濾膜反應器；再連續泵入RNA緩衝液，保持温度60～70℃，泵入速度0．5～1．5ml/min；收集滲透液並經分離、濃縮、結晶，得到5′－核苷酸產品。本發明能連續生產，操作方便，成本低，水解率高。

主權項：

一種由核糖核酸連續酶水解制5′－核苷酸的方法，其特徵在於：在水解過程中使用了超濾膜反應器，工藝過程如下：－－將核酸酶P↓[1]注入膜反應器（5）的反應腔中，其中核酸酶P↓[1]的濃度為100～10，000μ/ml，反應器的膜採用聚碸超濾膜，膜截留分子量為5000～10，000；－－保持膜反應器（5）温度在60～70℃，並連續泵入濃度為1～10%的RNA酯酸緩衝液，其PH=5．0～6．0，緩衝液中還含有0．01～0．1mM的ZnSO↓[4]，泵入速度在0．5～1．5ml/min之間；－－收集滲透液分離、濃縮、結晶，最終得到5′－胞苷酸，5′－鳥苷酸，5′－腺苷酸和5′－尿苷酸。