慢病毒載體

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 來源的一種病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統的主要組成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細胞或活體組織，實現外源基因在細胞或活體組織中表達。

慢病毒載體輔助成分包括： 慢病毒包裝質粒和可產生病毒顆粒的細胞系。

慢病毒載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄幷包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液後，可以直接用於宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之後，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。

慢病毒載體系統由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。

由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構建到兩個質粒上，一個質粒表達Gag和Pol蛋白，另一個質粒表達Env蛋白，其目的也是降低恢復成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個質粒共轉染細胞(如人腎293T細胞)，即可在細胞上清中收穫只有一次性感染能力而無複製能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啓動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。

為降低兩種成分同源重組恢復成野生型病毒的可能，需儘量減少二者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成鉅細胞病毒(CMV)立即早期啓動子、3′LTR換成SV40 polyA等。

採用表達水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的質粒和雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的質粒，分別取代表達HIV本身包膜蛋白Env的質粒，使HIV-1載體顆粒包上了VSV或雙嗜性MLV的 包膜。這樣做的結果至少具有三個方面的積極意義：①包膜的更換進一步降低了慢病毒載體恢復成野生型病毒的可能；②使HIV載體感染宿主的範圍不再僅限於CD4+細胞，而擴大到幾乎能感染所有組織來源的細胞；③VSV的包膜賦予慢病毒載體顆粒高度的穩定性，使其能夠通過超速離心而濃縮，達到高滴度。Naldini等已使慢病毒載體滴度由105轉錄單位(TU)/ml達到108TU/ml。

包裝成分的構建應在不重組病毒的裝配和感染力的前提下，儘可能地減少無關的HIV-1蛋白的表達，為野生型病毒的恢復設置障礙。Naldini等在構建包裝質粒時，阻止env基因的表達。在此基礎上，Zufferey等將包裝包裝質粒上表達調節蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4個基因分別刪除或聯合刪除。這4個調節蛋白或已被證實、或被高度懷疑是構成HIV毒性的因素，將其刪除、加上包膜蛋白的替換，可使製備HIV載體過程中產生野生型病毒的可能必微乎其微。

載體質粒上HIV-1的順式序列通常包括兩端的LTR、剪切位點及包裝信號Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高載體RNA的包裝效率；Rev蛋白需要與Rev反應元件(RRE)相作用，將未剪切的載體轉錄產物從細胞核轉運到胞漿。因此，Naldini等在載體上保留了gag基因5′端350bp的序列及位於env序列中的RRE，提高了產生載體顆粒的能力。 ^[2] 

獲得性免疫缺陷綜合徵(AIDS)的基因治療

對於AIDS的基因治 療方案，基本上是以逆轉錄病毒載體介導的方式，將抗病毒基因體外導入CD4+T淋巴細胞或CD34+的造血祖細胞，再回輸體內。常用的抗病毒基因包括自殺基因、反義RNA、核酶、RNA誘餌的相應DNA序列以及調節蛋白或結構蛋白的突變體基因等。由於這些治療基因不能到達巨噬細胞和多能幹細胞，因此難以重建免疫；此外，體外操作費用昂貴，不適於大規模應用。　慢病毒載體的為AIDS的基因治療帶來了新的希望，它可能具有以下優勢：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的載體顆粒可以將抗病毒基因直接運抵CD4+T淋巴細胞和巨噬細胞，適於直接的體內治療，而包被了VSV包膜的載體顆粒又能感染多能幹細胞，有利於免疫重建；第二，患者體內的野生型HIV-1可將攜帶抗病毒基因的載體拯救出來，使載體擴增並擴散到周圍更多的細胞中發揮抗病毒作用；第三，如果將抗病毒基因置於HIV-1本身的長末端重複序列(LTR)控制之下轉導細胞，則只有當HIV-1感染該細胞時，Tat蛋白反式激活LTR中的TAR元件，抗病毒基因才會表達，使基因表達具有了靶向性。

Lesch-Nyhan綜合徵是一種遺傳性的代謝性腦病，由編碼次黃嘌呤核糖轉移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一種退行性腦病，由於產生多巴的神經元退化，導致大腦紋狀體內多巴胺水平降低，臨牀上給患者注射左旋多巴可改善症狀，但長期注射及藥物的副作用令患者難以承受。較為理想的方式是在腦內持續表達酪氨酸羥化酶(TH)，使其催化酪氨酸轉變為為左旋多巴；Alzheimer氏病也是一種多因素引起的退行性腦病，造成大腦皮質和海馬迴神經元萎縮，通常採用神經營養因子防止神經元退化。由於慢病毒載體能夠體內轉導神經元並建立長期穩定的表達，因此對於以上疾病的基因治療非常具有吸引力。可以設想，分別將編碼HPRT、TH或神經營養因子的基因通過慢病毒載體介導，體內注射至神經元，有可能對上述疾病產生良好效果。

造血幹細胞一直被認為是對血液系統惡性腫瘤或其它疾病(如地中海貧血、鐮刀性紅細胞貧血、血友病等)進行基因治療的理想靶細胞，但由於缺乏使目的基因在造血幹細胞穩定表達的，這方面的研究進展不明顯。儘管小鼠逆轉錄病毒載體能夠轉導經細胞因子刺激後進入細胞週期的造血幹細胞，但經此處理的幹細胞性質可能會發生改變。慢病毒載體則可通過直接轉導靜止的幹細胞避免這類。將多藥耐藥(MDR)基因導入造血幹細胞，可使其耐受大劑量化療，可能成為治療白血病和其它惡性腫瘤的有效途徑；將正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分別導入造血幹細胞，有望對地中海貧血、鐮刀性紅細胞貧血和血友病產生療效。

儘管慢載體的研究有了很大進展，但距離臨牀應用還有很長的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，除Naldini等報道的結果外，其餘均在101TU/ml～103TU/ml之間，難以達到體內應用的需要；其次，由於HIV複雜的生物學性質，要像常用的小鼠逆轉錄病毒載體那樣建立穩定的HIV載體包裝細胞十分困 難，已建立的包裝細胞均不理想。據報道，Vpr是一種使細胞進入靜止期的強誘導劑，也是建立包裝細胞的主要障礙之一。如果確如前文所述，包裝質粒中的vpr基因並非必需、去除後不影響載體的轉導能力，則建立穩定的包裝細胞是大有希望的。

在保證HIV-1載體的安全性上，迄今已做了種種努力，要產生有複製力的HIV，必須在不同的質粒上發生多次非同源重組事件。即使如此，一旦用於人體試驗，仍然不能打消人們對感染有複製力的HIV-1的顧慮。更為謹慎的做法是，以非人類的慢病毒為基礎構建載體，如猴免疫缺損病毒(SIV)、貓和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等，而這些工作尚屬空白。

參考資料