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病毒包裝
鎖定
- 中文名
- 病毒包裝
- 外文名
- Virus packaging
- 隨 着
- 分子生物學的理論及技術方法
- 構 建
- 各種載體、克隆及分析目標基因
- 誕生了
- 基因診斷、基因治療技術
病毒包裝應用領域
當代基因治療研究的熱門方法是將外源基因DNA或RNA片段導入靶細胞或組織,研究靶基因的上調或抑制情況。例如,有些異常基因(癌基因、病毒基因),可通過反義核酸技術引入外源片段將其抑制;有些基因本身有治療作用,體外合成該基因導入體內使其表達丰度提高。
故選擇合適高效的基因導入介質系統尤為關鍵。而病毒載體已成為當前基因治療載體研究的熱點,其優勢在於:
1、病毒包裝技術經歷了多年的研究,已趨於成熟,可用於產業化大量生產。
2、病毒基因組的結構簡單、分子背景比較清楚,穩定易於改造、易於製備。
3、病毒的宿主範圍廣,且具有高效的靶向特異性。
5、通過載體改造的方式形成了複製缺陷型結構,安全性高。
幾種病毒載體的區別:
- | 腺病毒表達系統 | 慢病毒表達系統 | 逆轉錄病毒 |
病毒基因組成 | 雙鏈DNA | 單鏈RNA | 單鏈RNA |
載導容量 | < 8 kb | < 5 kb | < 6 kb |
基因整合功能 | 有。病毒基因組整合於宿主基因組,長時間、穩定表達外源基因 | 有。 | |
表達丰度 | 高 | 中 | 中 |
表達時間 | 快(1-2天) | 慢(2-4天) | 快(1-2天) |
感染細胞類型 | 分裂和不分裂細胞 | 分裂和不分裂細胞。適用於難轉染細胞 | 感染分裂細胞,但在幹細胞中表達效率低 |
滴度TU/ml | 10^12 | 10^9 | 10^9 |
四環素誘導系統 | 不可以 | TET-ON , TET-OFF | 不可以 |
毒性作用 | 遺傳毒性 | ||
高免疫原性 | 低免疫原性 | 低免疫原性 | |
動物模型 | 不能得到轉基因動物 | 可產生轉基因動物,效率達50以上 | 可以,但很難 |
安全係數 | 高 | 高 | 中 |
能否用於MIRCORNA | 可以 | 可以 | 不可以 |
RNAi | 病毒進入細胞往往引起細胞內干擾素反應,不適合做RNAi實驗 | 適合,是RNAi實驗的優選工具 | 可以用作RNAi實驗 |
基因過表達 | 包裝容量較大。可以滿足較大基因的包裝,是過表達基因的優選工具 | 包裝容量有限,過表達的基因過大時,病毒滴度受到影響 | 包裝容量有限,過表達的基因過大時,病毒滴度受到影響 |
常見應用 | 1、體外細胞基因轉導2、基因治療 | 1、體外細胞基因轉導2、基因治療 | 1、體外細胞基因轉導2、全基因組插入失活突變篩選3、功能基因庫構建 |
病毒包裝慢病毒
2、可裝載DNA片段容量高達5kb
4、病毒載體顆粒通過包裝元件和含病毒基因組質粒共轉染包裝細胞系。利用逆轉錄機制構建自我失活(SIV)的HIV-1來源的載體,一旦轉移到靶細胞後,它就喪失了病毒長末端重複的轉錄能力,減少了產生重組病毒的機會,並避免了與啓動子干擾的問題。
5、比較廣泛採用的第三代包裝系統——四質粒系統只含有HIV-1共9個基因中的3個,即gag、pol、rev。由於HIV-1基因組成分中60 %被去除,因此父代病毒無法複製,是重組係數最低的一個慢病毒包裝系統,至今未見重組報道。其更安全、更穩定、更高效的技術優勢領先於市場上的三質粒及其他包裝系統。
綜上特點決定了其應用、意義:
作為快速有效的遺傳物質投遞工具,慢病毒在國內已廣泛流行,更有眾多包裝服務公司興起。同時,克服了對病毒的恐懼心理而選擇自己包裝的研究者也陸續增加。外包服務和DIY(Do It Yourself)相比,後者成本會大大降低。僅需買一個包裝試劑盒、構建一個慢病毒載體即可進行實驗。GeneCopoeia公司提供了一款基於第三代包裝系統的包裝試劑盒。試劑盒中包含除慢病毒基礎載體和包裝細胞外的其他所有成分:包裝輔助質粒混合物,滴度增強劑,慢病毒專用轉染試劑(EndoFectin Lenti),eGFP陽性對照質粒。
慢病毒包裝實驗步驟與注意事項:
- 材料準備:包裝試劑盒、病毒質粒、細胞;(注意事項:包裝試劑盒的使用遵照説明書。檢測病毒質粒濃度,確保DNA的OD(260nm/280nm)處於1.8-2.0之間,並電泳檢測質粒是否完整。包裝實驗前準備好細胞,保證細胞狀態良好。)
- 製備DNA/轉染試劑複合物:此步驟比較簡單,僅需按照試劑盒説明書操作。
- 收穫病毒:收集轉染48小時後的培養液,500 *g離心10分鐘,去除細胞碎片雜質。接着用0.45 μm的聚醚碸蛋白結合過濾膜去除蛋白等雜質。收穫純度較高的病毒。
- 檢測滴度。
病毒包裝腺病毒
腺病毒(adenovirus )
腺病毒顆粒沒有包膜的直徑為70~90nm的顆粒,由252個殼粒呈二十面體排列構成。每個殼粒的直徑為7~9nm。衣殼裏是線狀雙鏈DNA分子,約含35 000 bp,兩端各有長約100 bp的反向重複序列。
特點:
2、腺病毒基因組較大(36kb)絕大多數基因組均能被外源基因取代,故插入大片段外源基因的潛力大。
5、能自行復制,有效進行增殖,產生滴度高;
6、與人類基因同源;
綜上腺病毒載體的特點,產生了其應用和意義:
2、應用於信號轉導,基因轉位,Co-IP,動物實驗,幹細胞研究等科研實驗。
3、可以完成較高難度的克隆構建,包括具有細胞毒性作用基因的腺病毒構建,在短時間內完成從原始質粒到病毒DNA的構建工作。
病毒包裝逆轉錄
逆轉錄病毒
原理:
逆轉錄病毒的共同特性——
1、球形,有包膜,80~120 nm
2、基因組:單股RNA二聚體,核心有逆轉錄酶
3、複製通過DNA中間體,能與宿主細胞DNA整合
應用:
1、基因轉染和穩定表達
2、具有在基因治療和生物製藥等領域的應用潛力
- 參考資料
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- 1. 慢病毒包裝實驗流程