心肌細胞

根據它們的組織學特點、電生理特性以及功能上的區別，可以粗略地分為兩大類型，兩類心肌細胞分別實現一定的職能，互相配合，完成心臟的整體活動 ^[1]  。

一類是普通的心肌細胞，包括心房肌和心室肌，含有豐富的肌原纖維，執行收縮功能，故又稱為工作細胞。工作細胞不能自動地產生節律性興奮，即不具有自動節律性；但它具有興奮性，可以在外來刺激作用下產生興奮；也具有傳導興奮的能力，但是，與相應的特殊傳導組織作比較，傳導性較低。

另一類是一些特殊分化了的心肌細胞，組成心臟的特殊傳導系統；其中主要包括P細胞和浦肯野細胞，它們除了具有興奮性和傳導性之外，還具有自動產生節律性、興奮的能力，故稱為自律細胞，它們含肌原纖維甚小或完全缺乏，故收縮功能已基本喪失。還有一種細胞位於特殊傳導系統的結區，既不具有收縮功能，也沒有自律性。只保留了很低的傳導性，是傳導系統中的非自律細胞，特殊傳導系統是心臟內發生興奮和傳播興奮的組織，起着控制心臟節律性活動的作用。

1.心肌細胞為短柱狀，一般只有一個細胞核，而骨骼肌纖維是多核細胞。心肌細胞之間有閏盤結構。該處細胞膜凹凸相嵌，並特殊分化形成橋粒，彼此緊密連接，但心肌細胞之間並無原生質的連續。心肌組織過去曾被誤認為是合胞體，電子顯微鏡的研究發現心肌細胞間有明顯的隔膜，從而得到糾正。心肌的閏盤有利於細胞間的興奮傳遞。這一方面由於該處結構對電流的阻抗較低，興奮波易於通過；另方面又因該處呈間隙連接，內有15～20埃的嗜水小管，可允許鈣離子等離子通透轉運。因此，正常的心房肌或心室肌細胞雖然彼此分開，但幾乎同時興奮而作同步收縮，大大提高了心肌收縮的效能，功能上體現了合胞體的特性，故常有“功能合胞體”之稱。

2.心肌細胞的細胞核多位於細胞中部，形狀似橢圓或似長方形，其長軸與肌原纖維的方向一致。肌原纖維繞核而行，核的兩端富有肌漿，其中含有豐富的糖原顆粒和線粒體，以適應心肌持續性節律收縮活動的需要。從橫斷面來看，心肌細胞的直徑比骨骼肌小，前者約為15微米，而後者則為100微米左右。從縱斷面來看，心肌細胞的肌節長度也比骨骼肌的肌節為短。

3.在電子顯微鏡下觀察，也可看到心肌細胞的肌原纖維、橫小管、肌質網、線粒體、糖原、脂肪等超微結構。但是心肌細胞與骨骼肌有所不同；心肌細胞的肌原纖維粗細差別很大，介於0.2～2.3微米之間；同時，粗的肌原纖維與細的肌原纖維可相互移行，相鄰者又彼此接近以致分界不清。心肌細胞的橫小管位於Z線水平，多種哺乳動物均有縱軸向伸出，管徑約0.2微米。而骨骼肌的橫小管位於A－I帶交界處，無縱軸向伸出，管徑較大，約0.4微米。心肌細胞的肌質網叢狀居中間，側終池不多，與橫小管不廣泛相貼 ^[2]  。

心肌細胞生物電產生的基礎：心肌細胞跨膜電位取決於離子的跨膜電-化學梯度和膜對離子的選擇性通透 ^[3]  。

心室肌細胞跨膜電位及其產生機理

1．靜息電位：心室肌細胞在靜息時，細胞膜處於外正內負的極化狀態，其主要由K+外流形成。

2．動作電位：心室肌動作電位的全過程包括除極過程的0期和復極過程的1、2、3、4等四個時期。

0期：心室肌細胞興奮時，膜內電位由靜息狀態時的-90mV上升到+30mV左右，構成了動作電位的上升支，稱為除極過程（0期）。它主要由Na+內流形成。

1期：在復極初期，心室肌細胞內電位由+30mV迅速下降到0mV左右，主要由K+外流形成。

2期：1期復極到0mV左右，此時的膜電位下降非常緩慢它主要由Ca2+內流和K+外流共同形成。

3期：此期心室肌細胞膜復極速度加快，膜電位由0mV左右快速下降到-90mV，歷時約100~150ms。主要由K+的外向離子流（Ik1和Ik、Ik也稱Ix）形成。

4期：4期是3期復極完畢，膜電位基本上穩定於靜息電位水平，心肌細胞已處於靜息狀態，故又稱靜息期。Na+、Ca2+、K+的轉運主要與Na+--K+泵和Ca2+泵活動有關。關於Ca2+的主動轉運形式，當前，多數學者認為：Ca2+的逆濃度梯度的外運與Na+順濃度的內流相耦合進行的，形成Na+-Ca2+交換。

蒲肯野細胞的跨膜電位及產生機理

蒲肯野細胞的動作電位及其產生機理與心室肌細胞基本相似，但其有4期自動除極化。4期自動除極化是膜對Na+通透性隨時間進行性增強（If內向電流）的結果。If通道與快Na+通道的主要區別是：①If的通道對離子的選擇性不強，雖然主要選擇的是Na+，但還有K+參與。而快Na+通道的選擇性強，主要允許Na+通透。②If的通道在復極達-60mV左右被激活，而快Na+通道在膜內電除極達-70mV左右被激活。③If的通道可被銫（Cs）所阻斷，而快Na+通道可被河豚毒阻斷。

竇房結P細胞跨膜電位及產生機理

1．P細胞動作電位的主要特徵4期膜電位不穩定，可發生自動除極，這是自律細胞動作電位最顯著的特點。

此外:

1）除極0期的鋒值較小，除極速度較慢，約為10V/s，0期除極只到0mV左右。

2）復極由3期完成，基本沒有1期和2期。

3）復極3期完畢後進入4期，這時可達到的最大膜電位值，稱為最大舒張電位（或稱最大復極電位），約為-70mV。

心肌細胞

2．P細胞動作電位的形成及離子流的活動

（1）0期除極的形成：0期除極的內向電流主要是由鈣離子負載的。

（2）3期復極的形成：0期除極後，慢鈣離子通道逐漸失活。3期是由鈣離子內流和鉀離子外流共同作用的結果。

（3）4期自動除極的形成：當前研究與三種離子流有關。

A：鉀離子外流的進行性衰減；

B：鈉離子內流的進行性增強；

C：生電性Na+--Ca2+離子交換。

心肌細胞的電生理學

心肌細胞的電生理學分類

心肌細胞除了解剖生理特點分為工作細胞（非自律細胞）和自律細胞外，還可根據心肌細胞動作電位的電生理特徵（特別是0除極速率），把心肌細胞所產生的動作電位分為兩類：快反應電位和慢反應電位，而把具有這兩不同電位的細胞分別稱為快反應細胞和慢反應細胞：

1.快反應細胞包括：心房肌、心室肌和蒲肯野細胞，其動作電位特點是：除極快、波幅大、時程長。

2.慢反應細胞包括竇房結和房室交界區細胞，其動作電位特點是：除極慢、波幅小、時程短。

心肌細胞分類小節如下：

自律細胞

快反應自律細胞：如蒲肯野氏細胞

慢反應自律細胞：竇房結和房室交界區（房結區，結希區）細胞

非自律細胞快反應非自律細胞：心房肌、心室肌細胞

慢反應非自律細胞：結區細胞

美國科學家在《自然》（Nature）雜誌上發表研究報告指出，發現了一組可培植心肌細胞的幹細胞。帶領這項研究的科學家正是華人WilliamPu。美國麻省波士頓兒童醫院的研究人員表示，新發現的幹細胞位於心臟最外層的心外膜，或能修復已受損害的心臟組織。WilliamPu稱：“當病人心臟出現問題時，便會失去驅動心跳的心肌細胞。補救方法就是製造更多這類細胞。”據悉，研究人員是在偶然的情況下發現新幹細胞的。他們當時正在研究心外膜的另一組基因，所以要在活老鼠的胚胎上，用紅色熒光蛋白複合體標籤特定的細胞。出乎意料之外，他們竟然目睹心外膜細胞轉化成心肌細胞。WilliamPu的研究成果顯示，用基因編號為“Wt1”的幹細胞能製造出心肌細胞、滑肌細胞及內皮細胞。

心肌組織包括心肌細胞和間質兩部分，其中心肌細胞佔心臟總體積的75%；間質佔25%。心肌細胞肥大是指心肌細胞體積增大直徑增寬或長度增加和肌節數量增多，心肌過度肥大時可有心肌細胞增生。

細胞學基礎

心肌細胞是一種高度分化的終末細胞，其收縮蛋白以α-肌球蛋白(α-MHC)為主，主管收縮功能。收縮蛋白包括肌球蛋白，肌動蛋白、向肌球蛋白及向寧蛋白。其中肌球蛋白包括2個重鏈(MHC)、2個輕鏈(MLC)，心臟僅有兩種MHC基因表達即α-MHC和β-MHC形成α-α、β-β同二聚體及α-β異二聚體，分別形成同功酶V1、V2及V3。正常情況下，胚胎心房及成人心房α-MHC即V1同功酶佔優勢，而左右心室從胚胎到成人β-MHC始終保持在80%～90%，以V3同功酶佔優勢。心肌細胞一般不能增殖，只有細胞體積的肥大，處於收縮狀態。胚胎期心肌細胞來源於肌幹細胞，經肌母細胞逐漸分化成成熟的心肌細胞，其收縮蛋白以β-MHC佔優勢，處於“合成狀態”，心肌肥大是心肌細胞從成熟的“收縮狀態”向“胚胎型合成狀態”轉化的一種現象。

心肌細胞肥大時，其表型變化，體積增大，心肌細胞內收縮蛋白類型改變，同時也可有心肌間質細胞增殖。心肌細胞和間質細胞的生長有各自的調控機制，心肌細胞肥大可伴有也可不伴有間質細胞的增殖。

原因和機制

1958年Teare對肥厚性心肌病進行了描述，從此，人們一直對心肌肥厚的發生機制進行研究，研究表明心肌肥厚是一種複雜的多種因素參與調節的動態過程。心肌細胞肥大發生的生化基礎是心肌蛋白合成的增加，導致細胞體積的增加。各種機械刺激，化學因素作用都可導致心肌肥大。

1.機械性刺激的直接作用　長期的壓力和/或容積負荷過度。使心室壁應力增加，導致心肌肥大。整體實驗表明心臟受到負荷刺激時可發生心肌肥大。機械性刺激可通過促進蛋白質合成增加或/和促使蛋白質降解減少而導致心肌肥大。其機制為(1)細胞內CAMP增加在搏動或停搏的心臟，其主動脈壓從7.98kPa(60mmHg)升至15.96kPa(118mmHg)時，其蛋白質合成增加，核蛋白形成增多，CAMP含量增多及CAMP依賴性蛋白激酶活性增加，提示動脈壓力增高可通過CAMP依賴性作用機制加速蛋白質合成。(2)細胞內肌醇磷酯增加Portzer等報告，主動脈狹窄造成左室肥大時，肥大心肌的細胞漿蛋白激酶(PKC)活力較對照增加15%，細胞膜PKC活力增加40%。説明心肌牽張增加心肌內肌醇磷酯含量的原因可能是由於磷脂酶C的激活。(3)原癌基因表達增加　在壓力負荷過重所致心肌肥大早期，可觀察到原癌基因表達增加。(4)肌動蛋白和肌球蛋白基因表達增加　培養的心肌細胞持續受到牽張刺激時，其β-MHC和α-肌動蛋白的基因表達增加。(5)其它　心肌細胞間鈣離子通道，鈉離子內流及細胞內環境鹼性比等均可在牽張刺激所致的心肌肥厚中起重要調節作用。

2.化學性刺激　體液因素亦可促進細胞的肥大或增殖。(1)去甲腎上腺素(NE)，動物實驗證明，長期注射亞高血壓劑量的NE可誘發心肌肥大，這種心肌肥大可能主要通過α1-R起作用，亦有學者將NE加入心肌細胞培養液中發現myc基因轉錄可見增加5～10倍，並促進心肌肥大，這一反應可被特異性α1受體拮抗劑所阻斷可為蛋白激酶C、活化劑PNA所加強，提高NE是通過α-受體、激活磷脂酰肌醇，蛋白激酶C系統，激活癌基因表達起作用的。(2)雄激素Cabral等在大鼠去壓力感受器神經後誘發的神經源性高血壓中發現，雄性大鼠左室重量/體重比值明顯高於雌性，給睾酮可引起類似雄性神經源性高血壓大鼠的左室心肌肥厚，而給予雌二醇則可抑制左室重量增加，其機理尚不清，可能與癌基因有關。(3)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)AngⅡ受體分AT1與AT2兩亞型，AT1受體與心肌的正性變力和變時作用及心肌細胞的生長肥大有關將AngⅡ加入心肌細胞培養液中，c-fos、c-jun、c-mye等原癌基因表達迅速加強，並促使蛋白質合成增加，誘導心肌肥大。AngⅡ還可引起血管緊張素原基因和轉化生長因子β1基因上調，進而促使心肌細胞肥大，這一反應可被AngⅡAT1受體阻斷劑阻斷，亦可被PKC加強，提示AngⅡ是通過AT1受體激活磷酸肌醇酯—蛋白激酶C系統，激活原癌基因表達的。(4)內皮素(ET)1988年由Yangisawa等從豬主動脈內皮細胞分離出一種縮血管多肽。ET是通過與靶細胞上ET受體結合，發揮作用，調節細胞增殖的。ET受體分為ETA、ETB、ETC，心血管肌細胞富含ETA，ETA所致心肌肥大，可能是通過增加肌球蛋白的輕鍵2、α-肌動蛋白、肌鈣蛋白及α、β肌球蛋白重鏈mRNA的表達。有人報道ETA也可能在體內NE導致的心肌肥大中起作用。(5)生長激素(GH)及胰島素類生長因子(TGF)Antonio等人觀察了GH及TGF1對大鼠心血管系統的影響，發現心肌為GH及IGF-1的靶器官，給予正常成年人大鼠外源性GH及IGF-1，可致其心肌肥大。容量和壓力負荷的增加，可使心臟IGF-1的基因表達增強。GH和IGF-1也可能間接通過胰島素代謝或腎上腺素系統起作用。(6)白細胞介素6(IL-6)與細胞肥大因子(CT-1)keiko等人發現心肌細胞在缺氧，再灌注及受到其它因子刺激時，可分泌大量IL-6，且與心肌肥大有關。IL-6作為配體，與IL-6受體結合後，使與其相連的GP130形成同型二聚體，這樣酪氨酸激酶被活化，Ras-Paf-map激酶等一系列反應隨之發生，促進細胞基因轉錄活性增高。CT-1是從小鼠胚胎幹細胞分化誘導期的上清液中分離出來的分子量為21.5KDa的蛋白質。有人報道：心肌細胞同樣產生CT-1，也通過GP130影響細胞內傳導信息的。CT-1刺激心肌細胞肥大的作用比AngⅡ和ET還強，CT-1亦可使心肌細胞c-fos、c-jun及ANP、mRNA表達增多，説明CT-1調節細胞基因活化和轉錄水平。

心肌細胞的離子通道和離子流，是心肌細胞電生理學的主要內容，它的研究進展非常迅速，特別是分子生物學的研究相結合，可以説是突飛猛進。如今，離開對心肌細胞電生理學，特別是對其離子通道和離子流的理解，就很難讀懂現代心臟生理學，藥理學，以及某些心臟病的發病機制及治療的著作。而心臟藥理學的很多章節，如果離開這些內容，就難以成為現代的藥理學。由此可見，這一領域的重要性。

在國外，心肌細胞電生理學的著作，日益增多，而在國內，則寥寥無幾，而為臨牀醫生所讀的著作，更是缺如。

目的

建立心肌細胞培養模型，用於心肌細胞體外實驗。

方法

採用胰酶消化及新生大鼠心肌細胞與非心肌細胞如成纖維細胞、血細胞等的差時貼壁法分離提純心肌細胞，建立心肌培養模型。

結果

心肌細胞培養最長成活時間達3天，心肌細胞受消化時間的影響有不同的形態表現。

結論

可以利用差時貼壁法分離新生鼠心肌細胞並在體外進行培養，胰酶消化以低濃度短時間為佳。

材料

1.心肌細胞的消化

取一隻加蓋燒杯，內放一塊用乙醚飽和的紗布，把0~3日齡的大鼠幼鼠放進該燒杯中麻醉，用2%碘酒和75%酒精消毒胸腹皮膚，在無菌條件下開胸取出心臟，立即置於4ºCD-Hanks液(mmol/L：Nacl137,Kcl5.4,Na2HPO40.37,K2HPO40.44,NaHCO34.2)中剪取心室肌，洗淨殘血，剪成約1mm³大小的組織塊，棄去D-Hanks液加入0.08%胰蛋白酶液10~15ml，於37°C靜置5min，吸出上層懸液，並加入等量的含血清培養基。經終止消化後離心(1800r/min)棄上清液，加入含血清的培養液。吹散沉澱細胞，同條件下離心，用10%血清培養液製成細胞懸液，置於37°C含5%CO2培養箱中。

心肌細胞分離

根據心肌細胞和非心肌細胞貼壁時間的不同採用2小時差速貼壁，分別獲得心肌成纖維細胞和心肌細胞。心肌細胞按1*106個細胞/ml種於50ml培養液中，培養的前2天在心肌細胞培養液中加入5-溴脱氧嘧啶核苷0.1mmol/l，以抑制非心肌細胞增殖，所有培養的心肌細胞均每2天換液一次。

1.3心肌細胞的無血清培養

當心肌細胞培養24小時後換無血清培養液（含DMEM培養液，胰島素10g/ml,鐵蛋白10g/ml，維生素C100g/L維生素B121.5µmol/L）繼續培養48小時,每隔8小時換液一次,儘量保持各添加成分濃度不變,最後收集細胞,進行測定。

2.實驗結果

本次實驗中新生大鼠心肌細胞培養最長存活時間為3天。實驗採取低濃度，短時間胰蛋白酶消化的方法。消化時間不同，所得到的細胞有不同的形態變化:消化3~5分鐘，高倍鏡下觀察心肌細胞大部分呈新月形，並可見細胞在培養液中呈頭尾相連的過程，呈動態變化。而消化5~10分鐘的心肌細胞捲曲呈圓形,密度低,活動能力差。細胞培養約8小時後向一處聚集，彼此鈎連呈現高密度區，這可能與細胞之間形成連接有關。由於某種不明原因，多次培養過程中心肌細胞中都出現不明微生物，致使細胞在3天后基本死亡。

3.實驗討論

有很多文獻報道新生大鼠心肌細胞的培養時間為10~12天，本次實驗的培養時間為3天，與之比較成活時間較短,但本實驗可以説明低濃度胰蛋白酶消化液(0.08%)比一般濃度(0.125%)的消化時間效果好，消化時間在3~5分鐘內可減少細胞死亡率.實驗過程中出現的細胞向一處聚集的現象和可見的連續的形態變化，可以説明體外培養心肌細胞重新連接成更大單位細胞團是可能的，它們可能通過形態的變化相互鈎連，連接成網。