冰凍切片

冰凍切片（frozen section）是一種在低温條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然後進行切片的方法。因其製作過程較石蠟切片快捷、簡便，而多應用於手術中的快速病理診斷。冰凍切片的種類較多，有低温恆冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環制冷冰凍切片法等。這些方法，隨着時代的變遷，科技的發展，許多年前被認為是非常重要的技術，也逐步被淘汰了。當然有些技術，如低温恆冷箱冰凍切片法，正在受到重視。 ^[1] 

（1）在手術進行中，突然發現病人的病變與原診斷，原定手術方案不相符合，或者懷疑時，需要病理確定。

（2）瞭解淋巴結內是否有轉移的腫瘤細胞，或者轉移的程度，以利於確定是否需要徹底掃除淋巴結或者其它的治療措施。

（3）對於已確定為惡性腫瘤的患者，則需要了解其手術範圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤組織。

（4）在做剖腹探查時所發現的腫塊或者異樣的組織。

（5）顯示組織中的脂肪和脂類物質，這常見於某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。

（6）某些酶的顯示如ATP酶，琥珀酸脱氫酶等。

（7）神經病理學技術中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。

（8）對某些物質所進行的免疫熒光的研究。

術中為何做冰凍切片？

病理檢查首先需要將切下的病變組織器官作一系列技術處理，包括固定、取材、脱水、浸蠟、包埋、切片和染色等，一般需花費24小時方可完成全部製片過程，然後由病理醫生用顯微鏡觀察，並做出診斷。這種檢查方法稱為常規石蠟切片，是病理檢查中最常用的方法。但是，這種方法從外科醫生將病變組織切下，到做出病理診斷，前後通常需要3天的時間。有時外科醫生希望在手術過程中馬上了解病變的性質，以便及時確定手術範圍，並做出相應的處理，就要求病理醫生在手術過程中做出病理診斷，此時就必須快速切片診斷，快速冰凍切片是應用的最廣泛的方法。

快速冰凍切片是用於手術中病理診斷的一種方法，病理醫生在收到手術標本後約15分鐘之內做出診斷，馬上電話告訴手術醫生，以便迅速作出下一步治療決策。病理診斷的正確與否直接關係到手術枱上處理患者的下一個步驟，如乳腺腫塊切除後的冰凍報告是良性的纖維腺瘤，則可宣告手術結束；如冰凍報告是乳腺癌，就需要進一步擴大手術範圍，切除整個乳房及腋窩淋巴結；肢體的惡性腫瘤如骨肉瘤，通常需截肢。冰凍切片病理診斷對手術治療有重大幫助和指導意義，診斷要力求正確、迅速和可靠。

然而，快速冰凍切片要在如此之短的時間內做出診斷，難度相當高，取材有侷限性，製作切片的質量也不如常規石蠟切片高。因此，冰凍切片的確診率比常規切片低，有一定的延遲診斷率和誤診率，所以冰凍切片診斷尚不能廣泛應用，即使選擇性應用，事後仍需用常規石蠟切片對照和存檔。

快速冰凍切片主要用於下列幾種情況：

①確定病變是否為腫瘤；

②判斷腫瘤的良惡性；

③瞭解腫瘤有無播散到鄰近淋巴結或臟器；

④確定手術切緣有無腫瘤浸潤，以瞭解手術範圍是否足夠大；

⑤幫助識別手術中某些意外和確定可疑微小組織（如甲狀旁腺、輸卵管或輸精管等）；

⑥取新鮮組織供激素受體測定、腫瘤藥敏試驗、電鏡檢查和分子生物學檢查等特殊需要。 ^[2] 

低温恆冷箱冷凍切片製作法

以Shandon As 620 E型恆温箱冷凍切片機為例，該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啓動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態，並可持續10分鐘。啓動即時除霜鍵，可將工作間頂部後面的製冷柵上的霜除掉，並可持續15分鐘。有照明鍵一個，啓動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個，當進行一週的工作或者一天的工作後，啓動該鍵，可對工作間進行消毒。當每天工作完畢時，可啓動密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進退鍵，兩個為微小進退鍵，還有一個手動旋鈕，調節修組織塊時的進退。

冷凍箱內左邊的冷凍台，温度可達-60℃左右，冷凍箱的中間為一台切片機，工作間的温度在0-30℃間可任意調節，並在箱面上的熒屏顯示出來。

操作方法及步驟：

①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。

②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放於冷凍台上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小台後，再放上細小組織，滴上包埋劑。

③將冷凍好的組織塊，夾緊於切片機持承器上，啓動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。

④調好欲切的厚度，根據不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。

⑤調好防卷板。製作冰凍切片，關鍵在於防卷板的調節上，這就要求操作者要細心，準確地將其調較好，調校至適當的位置。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。

⑥應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經固定的腦組織，肝組織和淋巴結時，冷凍箱中的温度不能調太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調至-30℃。

冰凍切片時的注意事項：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持乾淨，需經常用毛筆挑除切片殘餘和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片後就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘餘的包埋劑粘於刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放於不同的支承器上，於冷凍台上凍起來，然後依據不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。

③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。

④組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨牀快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經固定前，其中的水分也可滲入到組織中去，當冰凍發生時，這些水分就存留於組織中，形成了冰晶。

⑤當切片時，如果發現冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調高冰凍點。

⑥用於附貼切片的載玻片，不能存放於冷凍處，於室温存放即可。因為當附貼切片時，從室温中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種温度差，當温度較高的載玻片附貼上温度較低的切片時，由於兩種物質間温度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由於温度相同，沒有發生上述的現象。

冰凍切片的快速染色法

冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定1分鐘後即可染色。以往，為了防止切片脱落，當切片附貼於載玻片後，即用電吹風吹乾後再固定。根據實驗對比認為這種做法欠妥未經固定的切片，強熱作用後，蛋白髮生變性，核內含有的物質由於熱的作用融合在一起，染色後鏡下分辨不出核內的各種物質。冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細胞內各種物質都在沒有任何變化的情況下被固定起來，核染色質清晰，核仁明顯，其他物質都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分鐘。

② 水洗。

③ 染蘇木素3－5分鐘。

④ 分化。

⑤ 於鹼水中返藍20秒。

⑥ 伊紅染色10－20秒。

⑦ 脱水，透明，中性樹膠封固。

冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘。總共在10分鐘內完成快速製片過程，結果與石蠟切片不相上下。

冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法已很少使用，因此在這裏不作闡述。

1．簡便，可以不需要對組織固定、脱水、透明、包埋等手續即可進行切片，減少了一些中間環節。

2．快速，用時短。

3．組織變化不大。

4．能很好保存脂肪，類脂等成分。

5．能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對於那些對有機溶劑或熱的温度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。

1．不容易做連續切片。

2．切取的組織不能過大，組織過大不容易凍結或者組織凍結不均，影響切片及染色效果。

3．不容易製作較薄的切片。

4．組織塊在凍結過程中容易產生水的結晶而影響細胞的形態結構及抗原物質的定位，並且組織結構也不如石蠟切片清晰。

新鮮組織的製備

組織儘可能新鮮、驟冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的驟冷劑有：① CO2氣（－78℃） ② 丙酮乾冰冷卻的輕石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ③ 液氮（－190℃）④ 液氮冷卻的丙烷（－19℃）。液氮適用於組織化學，較安全。缺點：組織塊易發生龜裂。

固定組織的製備

為防止水解酶和其他物質的移位、彌散，常用4℃、24小時的甲醛固定能很好地保存酶類。但對許多脱氫酶和轉移酶能滅活。故不宜使用，低温，冷甲醛短時間固定（10分鐘左右）固定，可顯示琥珀酸脱氫酶。

電鏡出現後，需要保存細胞的超微結構，以4%緩衝戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定較好。這些固定液主要用於水解酶，而不適於許多氧化還原酶和轉移酶。

恆冷箱的温度

一般在冷凍後10分鐘，到接近冷室温度時再切，一般組織在－15～－20℃切片最易成功。每種組織有其合適的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的經驗如下：

組織 刀温度 組織温度 恆冷箱温度

肝 -18 -10 -5

腎 -15 -8 -5

皮膚 -35 -10 -5

腦 -18 -5 -5

固定組織一般高3-5度

切片機的使用

抗卷板的前緣與刀面須有足夠的距離，使切片平滑通過。抗卷板略高於刀面的最高點。可憑經驗調整刀對組織的角度，一般新刀為20゜。操作程序：先接通電源，調定恆冷箱温度，調整切片刀的角度，調定切片厚度，標本置載台致冷達所需温度後，將其安放在切片機推進器上。即可切片。恆冷箱視使用情況每週或每月清潔一次冰霜。新刀切片滿意，舊刀用自動磨刀機磨刀較好。如果切片刀與抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把鋭利的刀，就能獲得理想的切片。

冰凍乾燥

為冰凍組織保持高度真空，直到去除組織中的水分。

小塊組織驟冷→立即在真空乾燥脱水（－30～－40℃）冰昇華，水氣去除，不會發生酶的彌散→材料幹後，升到室温浸於石蠟或碳蠟包埋。

能出色地保存組織的酶活性，還有助於保持組織的結構。但儀器貴，需時長。

冰凍替代法

低温下用液體脱水劑取代組織中的水分。

組織塊驟冷→組織內的水，在低温（－40℃～－70℃）液體脱水劑中被替代（醇、丙酮），同時起到固定作用→脱水組織漸恢復到室温，用石蠟包埋。

① 新鮮組織在24小時內製成切片。

② 可保存較多的酶活性。

③ 經濟、簡單且有重複性，但對細胞器保存不佳，不能用於電鏡。

防止脱片的方法

冰凍切片是較難掌握的病理實驗技術之一，要做好一張冰凍切片絕不能只求速度，否則常適得其反[2，3]。為了不漏診、誤診，及時準確地作出診斷，確保結果科學性、正確性、真實性，這就需要醫護人員在進行冰凍切片時應有嚴格的責任心、嚴謹的工作態度、密切聯繫臨牀、豐富的工作實踐經驗，不斷提高切片質量，總結經驗和教訓，這樣才能更好地為臨牀和科研服務。隨着科學技術的現代化實現，病理學科也引進了許多自動化裝置，如病理標本的自動脱水機，自動包埋機、自動切片機、自動染色機、自動免疫組化機等。並隨着互聯網技術的發展，開展了遠程病理圖文會診，為臨牀提供了更便捷、可靠、有效的診斷治療建議。 ^[3]