PCR實驗室

通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否複製、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨牀治療提供了可靠的檢驗依據

PCR是分子生物學研究和實驗的常規方法，應用於生物學和醫學的各個領域。例如：艾滋病檢測、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷，DNA指紋、個體識別、親子鑑定及法醫物證、動植物檢疫，動物及其衍生產品檢測，動物飼料、化妝品、食品衞生檢測，轉基因作物與轉基因微生物檢測等。 ^[1] 

1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室;

實時熒光定量PCR技術於1996年由美國Applied Biosystems公司推出

由於該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它

有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，已得到廣

泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室設置要求;

熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。

3、必須通過國家臨牀檢驗中心的驗收和認證;4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓並取得合格證書;

PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衞生部或各省臨牀檢驗中心舉辦的臨牀基因擴增培訓班，並持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨牀基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衞生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衞生安全，確保實驗室長期穩定運行

5、必須在無菌無塵環境下進行操作

能夠對患者病情進行科學、準確、實時的掌控，並結合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒複製的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒複製模板難以治療，人體免疫耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨牀症狀，而且有效抑制乙肝病毒複製，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。

1、建立樣品準備區

這個區域專門用作樣品的準備，在製備和操作用於核酸提取的試劑時應該採取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。⑶用於樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用於樣品準備間，經常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區。

該去專門用於準備各種反應，這個區域必須保持乾淨，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專門用於前PCR區的正壓活塞式移液管。

4、PCR實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，並且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品製備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配製，實驗一下看試劑是否滿意，然後分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配製的試劑在用於準備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。

5、在前PCR區建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝並保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致於配製包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配製和PCR前過程的效率和潔淨程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩衝液以證明裏面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。⑹由於必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。

7、後PCR區PCR完成以後，需要分析樣品並解釋數據，應該留出一個專門用於反應後處理樣品的地方。後PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用於這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用於任何前PCR活動

1、試劑配製室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染；可以通過控制進風風量大於排風風量達到正壓效果。

2、核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風風量大於進風風量達到負壓效果。

3、各個區域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。

4、實驗室的牆體，頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜採用圓弧形線條過渡；牆體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕要求。 ^[1]