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DNA測序方法
鎖定
- 中文名
- DNA測序方法
- 外文名
- DNA sequencing
DNA測序方法名詞解釋
DNA測序(DNA sequencing,或譯DNA定序),是RNA測序則通常將RNA提取後,反轉錄為DNA後使用DNA測序的方法進行測序。應用最廣泛的是由Frederick Sanger發明的Sanger雙脱氧鏈終止法,DNA sequencing technology,在分子生物學研究中,DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。用於測序的技術主要有Sanger等(1977)發明的雙脱氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert(1977)發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大,但都是根據核苷酸在某一固定的點開始,隨機在某一個特定的鹼基處終止,產生 A,T,C,G四組不同長度的一系列核苷酸,然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測,從而獲得DNA序列。
DNA測序方法發展歷史
2001年完成人類基因組框架圖
DNA測序方法測序方法
第1 代測序技術
熒光標記的Sanger 法—— 在分子生物學研究中,DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。用於測序的技術主要有Sanger(1977)發明的雙脱氧核糖核酸鏈末端終止法,Sanger測序法得到了廣泛的應用。Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始,隨機在某一個特定的鹼基處終止,並且在每個鹼基後面進行熒光標記,產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸,然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測,從而獲得可見的DNA鹼基序列。 Sanger法測序的原理就是,每個反應含有所有四種脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之擴增,並混入限量的一種不同的雙脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團,使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止,終止點由反應中相應的雙脱氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整,使反應得到一組長几個至千以上個,相差一個鹼基一系列片斷。它們具有共同的起始點,但終止在不同的的核苷酸上,可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段,凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
第2 代測序技術
循環陣列合成測序法—— 述第2 代測序技術中, 序列都是在熒光或者化學發光物質的協助下, 通過讀取DNA 聚合酶或DNA 連接酶將鹼基連接到DNA 鏈上過程中釋放出的光學信號而間接確定的. 除了需要昂貴的光學監測系統, 還要記錄、存儲並分析大量的光學圖像.這都使儀器的複雜性和成本增加. 依賴生物化學反應讀取鹼基序列更增加了試劑、耗材的使用, 在測序成本中比例相當大. 直接讀取序列信息, 不使用化學試劑, 對於進一步降低測序成本是非常可取的.在一個正在發生突破瓶頸鉅變的領域內, 很難準確預測未來將發生什麼.
第3 代測序技術
直接測序——將基因組DNA 隨機切割成大約100 kb 左右的片段,製成單鏈並與六寡聚核苷酸探針雜交. 然後驅動結合了探針的基因組文庫片段通過可尋址的納米孔陣列. 通過每個孔的離子電流均可獨立測量. 追蹤電流的變化確定探針雜交在每個基因組片段上的精確位置. 利用基因組片段上雜交探針的重疊區域將基因組片段文庫排列起來, 建立一組完整的基因組探針
DNA測序方法應用
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