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鬼筆環肽
鎖定
- 中文名
- 鬼筆環肽
- 外文名
- Phalloidin
- 性 質
- 劇毒生物鹼
- 特 點
- 無色,細針狀結晶
- 分子量
- 788.87
- 分子式
- C35H48N8O11S
- 熔 點
- 281 ℃
鬼筆環肽物質介紹
鬼筆環肽是最早發現的環狀肽之一。它是從Amanita phalloides中分離出來的,並於1937年由Feodor Lynen和Ulrich Wieland結晶。它的結構不同尋常,因為它包含一個半胱氨酸-色氨酸鍵,形成一個雙環七肽。這種連接以前沒有被表徵過,這使得鬼筆環肽的結構闡明變得更加困難。他們使用紫外光譜法確定了硫原子的存在,並發現該環結構的波長稍有偏移。雷尼鎳實驗證實了色氨酸環中存在硫。研究人員發現脱硫的鬼筆環肽仍然是圓形的,這表明鬼筆環肽的結構通常是雙環的。線性化後,Wieland和Schön於1955年通過“ Edman降解”闡明瞭脱硫鬼筆環肽的氨基酸序列。
由於其對肌動蛋白的高親和力,科學家發現了其潛在用途,可作為一種染色劑有效地觀察肌動蛋白顯微鏡檢查。與熒光團綴合的衍生物被廣泛出售。由於其能夠選擇性結合絲狀肌動蛋白(F-肌動蛋白)而不是肌動蛋白單體(G-肌動蛋白),熒光標記的鬼筆環肽比抗肌動蛋白的抗體更有效。
與鵝膏毒鹼(amanitin)一起存在,毒性比鵝膏毒鹼弱,對小鼠的致死劑量是50微克,對人體也有很強的毒性,可引起流涎、嘔吐、便血、發紺、痙攣、肌肉攣縮,以致死亡。它同細胞鬆弛素B的作用相反, 只與聚合的微絲結合, 而不與肌動蛋白單體分子結合。它同聚合的微絲結合後, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態平衡。通過讓這種毒素連接於熒光染料上面,研究人員可以研究細胞的內部工作機制,窺視細胞如何分裂。通過這些觀察,他們可以揭開癌症工作機制和組織生長之謎。
美國加州大學聖克魯斯分校的兩位化學家斯科特·洛基和勞拉·舒利斯科(Laura Schuresko)利用一種稱為固相合成(solid-phase synthesis)的手法,製造出了鬼筆環肽的類似物質穀氨酸7-鬼筆環肽(Glu7-Phalloidin)。另一位科學家(Anderson MO)合成出了鬼筆環肽的另一類似物質丙氨酸7-鬼筆環肽(Ala7-Phalloidin)。
美國多肽公司(American Peptide Company, USA)的研究人員劉寶生(Baosheng Liu)和張建恆(Jianheng zhang)利用固相合成和液相合成相結合的方法成功合成出了鬼筆環肽。用化學法合成的鬼筆環肽其物理和化學性質與從毒蘑菇中提取的天然鬼筆環肽一致
[1]
。
鬼筆環肽合成
鬼筆環肽生物合成
鬼筆環肽是一種雙環七肽,含有不尋常的半胱氨酸-色氨酸鍵。 編碼鬼筆環肽合成的基因是死亡帽蘑菇中MSDIN家族的一部分,編碼34個氨基酸的前肽。 脯氨酸殘基位於七個殘基區域的兩側,稍後將變成鬼筆環肽。 翻譯後,必須對肽進行蛋白水解切除,環化,羥基化,使Trp-Cys交聯形成色氨酸,並差向異構化以形成D-Thr。 這些步驟的順序和確切的生化機理尚未完全瞭解。 必要的生物合成基因聚集在MSDIN基因附近。
34-mer的第一個翻譯後修飾是通過脯氨酰寡肽酶(POP)進行蛋白水解切割,以去除10個氨基酸的“前導”肽。 然後,POP通過氨基酸1(Ala)和氨基酸7(Pro)之間的轉肽作用使七肽Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro環化。 據信,接下來將通過Trp-Cys交聯形成色氨酸。
鬼筆環肽化學合成
由於鬼筆環肽因其結合和穩定肌動蛋白聚合物的能力而被開發利用,但細胞無法輕易吸收,因此科學家發現鬼筆環肽衍生物在研究中更有用。 本質上,它遵循典型的使用羥脯氨酸的小肽合成。 合成的主要困難是色氨酸的形成(半胱氨酸-色氨酸交聯)。
以下是Anderson等人進行的一般合成機理。在2005年進行了ala7-鬼筆環肽的固相合成,其在殘基7與鬼筆環肽的區別如下。 THPP代表四氫吡喃基聚苯乙烯接頭,該接頭用於在合成過程中將分子與固體支持物連接。 注意,下面的合成只是顯示連接起始材料的鍵形成順序的一般方案。 Ala7-鬼筆環肽以及鬼筆環肽的許多其他類似變體可用於相對於鬼筆環肽增加細胞吸收並附着熒光團,以幫助在顯微鏡下觀察F-肌動蛋白。
鬼筆環肽的第一個全合成是通過固相和溶液相合成的組合實現的。 合成鬼筆環肽的物理和化學性質與天然鬼筆環肽相同。
鬼筆環肽作用機理
鬼筆環肽結合F-肌動蛋白,防止其解聚並中毒細胞。 鬼筆環肽特異性結合在F-肌動蛋白亞基之間的界面,將相鄰的亞基鎖定在一起。 鬼筆環肽(一種雙環七肽)與肌動蛋白絲的結合比與肌動蛋白單體的結合更緊密,從而導致肌動蛋白亞基從絲端解離的速率常數減小,這通過防止絲解聚而基本穩定了肌動蛋白絲。此外,發現鬼筆環肽抑制F-肌動蛋白的ATP水解活性。因此,鬼筆環肽以不同於G-肌動蛋白的構型捕獲肌動蛋白單體,並通過大大降低單體解離的速率常數來穩定F-肌動蛋白的結構,這是與ADP捕獲有關的事件。 總體而言,發現鬼筆環肽與肌動蛋白髮生化學計量反應,強烈促進肌動蛋白聚合並穩定肌動蛋白聚合物。
鬼筆環肽在細胞中不同濃度下的功能不同。 當鬼筆環肽以低濃度引入細胞質時,它將聚合度較低的細胞質肌動蛋白和纖維蛋白吸收到穩定的聚集的肌動蛋白聚合物“島”中,但不會干擾應力纖維,即厚的微絲束。Wehland等 還注意到在更高的濃度下,鬼筆環肽會誘導細胞收縮。
鬼筆環肽毒性
發現後不久,科學家將鬼筆環肽注射入小鼠體內,並通過IP注射發現其LD50為2 mg / kg。 當暴露於最小致死劑量時,這些小鼠死亡需要幾天時間。 鬼筆環肽中毒的唯一明顯副作用是極度飢餓。 這是因為鬼筆環肽僅通過膽汁鹽膜轉運蛋白被肝臟吸收。 一旦進入肝臟,鬼筆環肽會結合F-肌動蛋白,從而阻止其解聚。 此過程需要花費一些時間才能破壞肝細胞。 腎臟也可以吸收鬼筆環肽,但效果不如肝臟。 在這裏,鬼筆環肽會引起腎病。
鬼筆環肽用作顯影劑
熒光鬼筆環肽(紅色)標記內皮細胞中的肌動蛋白絲鬼筆環肽的特性使其成為研究F-肌動蛋白在細胞中分佈的有用工具,方法是用熒光類似物標記鬼筆環肽並用它們對肌動蛋白絲染色以進行光學顯微鏡檢查。鬼筆環肽的熒光衍生物在定位活細胞或固定細胞中的肌動蛋白絲以及體外觀察單個肌動蛋白絲方面非常有用。開發了一種高分辨率技術,通過使用與熒光團曙紅結合的鬼筆環肽(熒光素曙紅)來檢測光和電子顯微鏡下的F-肌動蛋白。在這種稱為熒光光氧化的方法中,可以利用熒光分子來驅動二氨基聯苯胺(DAB)的氧化,以生成反應產物,該產物可以使電子緻密並可以通過電子顯微鏡檢測。如果使用飽和量的鬼筆環肽,可視化的熒光量可以用作細胞中絲狀肌動蛋白量的定量測量。因此,免疫熒光顯微鏡和顯微注射鬼筆環肽可用於評估細胞質肌動蛋白在其聚合物形成的不同階段的直接和間接功能。因此,熒光鬼筆環肽可以用作高分辨率研究肌動蛋白網絡的重要工具。
鬼筆環肽使用和限制
鬼筆環肽比通常用於標記細胞蛋白以進行熒光顯微鏡檢查的抗體小得多,該抗體可以對絲狀肌動蛋白進行更密集的標記,並且可以獲取更詳細的圖像,尤其是在更高分辨率下。
未經修飾的鬼筆環肽不會滲透細胞膜,因此在活細胞實驗中效率較低。 已經合成了鬼筆環肽的衍生物,其細胞通透性大大提高。用鬼筆環肽處理的細胞具有多種毒性作用,並經常死亡。此外,重要的是要注意,用鬼筆環肽處理的細胞與其質膜相關的肌動蛋白水平更高,而將鬼筆環肽微注射入活細胞將改變肌動蛋白的分佈以及細胞運動性。
鬼筆環肽配製
鬼筆環肽染色程序
- 生理鹽水PBS清洗細胞2次,每次10分鐘;
- 3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定20分鐘,生理鹽水PBS清洗細胞2次;
- 加入5ug/ml的FITC-鬼筆環肽室温染色30-60分鐘,夏季時間可以短一些,生理鹽水PBS清洗細胞2次;
- DAPI或hoechst33258染細胞核10分鐘,生理鹽水PBS清洗細胞2次;
鬼筆環肽注意事項
- 鬼筆環肽的分子量小,很容易通過細胞,不需要對細胞進行冷丙酮和TRITON X-100處理。
- 藥品價格昂貴,0.1mg的售價接近兩千元,要節約使用。
- 毒性較大,戴上手套操作。