共聚焦顯微鏡

共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM） ^[2]  是近十多年研製成的高光敏度、高分辨率的新型儀器。它以激光為光源，由共聚焦成像掃描系統、電子光學系統和微機圖像分析系統組成。光束經聚焦後落在樣品(組織厚片或細胞)不同深度的微小一點，並作移動掃描，通過電信號彩色顯像，可使樣品內任何一點的反射光形成的圖像，都被準確地接收下來併產生信號，傳遞到彩色顯示器上，再連接微機圖像分析系統進行分析處理 ^[2]  。

共聚焦顯微鏡的工作原理 ^[3]  。

共聚焦系統的光源為離子激光器或HeNe激光器，光源發出的激光束通過照明針孔後成為點光源P。點光源P通過分束器進入高數值孔徑顯微物鏡的成像系統成像後，在部分透明的被測樣品內形成像點P。從像點P發出的散射光及反射光(波長為λ₁)和其他熒光(波長λ_f>λ₁),反方向經過物鏡和分光鏡後，入射到單點探測器。單點探測器由探測器和放置在探測器前的針孔組成，它可以減少探測器的有效面積。探測器一般使用的是光電倍增管或雪崩光電二極管，探測器接收到的電信號最後由計算機進行處理 ^[3]  。

①如果激光束聚焦點的直徑小於針孔的直徑,則P處的針孔可以去掉 ^[3]  。

②有些材料能自發熒光,有些材料則需要用合適的染料上色 ^[3]  。

根據共聚焦點相對於標本的移動方式,目前共聚焦顯微鏡可分為3種 ^[4]  。

其中最簡單的是在透鏡系統的光軸上固定住一個射限制點，控制其不發生術射，同時移動標本(標本掃描)( Brakenhoff, et al.,1989) ^[4]  ；

另一類是多點掃描型，弧形燈發出的光東經一個轉動孔板精細定位，平行地進行掃描和檢測( Egger and Petran,1967; Xiao and Kino,1987)，也就是轉盤共聚焦顯微鏡(spinning-disk confocal microscope ^[7]  ) ^[4]  ；

最為常見的類型是單點掃描，即通過移動反射鏡或使用聲光偏轉儀使激光通過光柵進行偏轉( Carlsen, etal, 1985) ^[4]  。

全內反射熒光顯微鏡（TIRFM） ^[5] 

共聚焦激光掃描顯微技術{ confocal laser scanning microscopy) ^[6] 

一般熒光顯微鏡對於薄樣品可獲得清晰的圖像，但當樣品較厚時，物平面之外的熒光分子也會被激發，而這些光在像平面上是彌散的，因而干擾成像質量。20世紀50年代, Minsky發明了共聚焦顯微成像方法，但直到20世紀70年代，激光光源和計算機技術的發展才使共聚焦技術真正得以實現。共聚焦的含義就是將聚焦平面以外的成像信息過濾，使其不在最終的成像結果中顯示，首先將光線聚焦於一點或一線，然後對所要觀察的平面進行掃描，焦平面以外的光線通過檢測針孔隔離 ^[6]  。