農桿菌轉化法

根癌農桿菌和髮根農桿菌中細胞中分別含有Ti(Tumour inducing)質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中，並且可以通過減數分裂穩定的遺傳給後代，這一特性成為農桿菌介導法植物轉基因的理論基礎。

科研人員將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然後通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。農桿菌介導法起初只被用於雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。

選擇一種特製的空質粒載體（如PBI121質粒載體），其上要求含有T-DNA邊界序列（此處可參見詞條雙元表達載體系統），在序列之間含有複製原點、抗性基因、GUS報告基因、Hind Ⅲ和BamH I 等酶切位點（以上這些構成了一個T-DNA區）。先通過雙酶切反應酶切空質粒載體和目的基因，再通過酶連反應連接空質粒載體和目的基因，從而構建成完整的重組質粒。此時重組質粒的T-DNA區包括T-DNA邊界序列、複製原點、突變啓動子片段、GUS報告基因、抗性基因。我們稱這段T-DNA區為目的片段。農桿菌轉化法的原理是構建雙元表達載體系統，由兩種質粒組成，一種是位於大腸桿菌中的穿梭質粒，另一種是位於農桿菌中的輔助性質粒。將重組質粒電轉化到農桿菌感受態細胞中後，用含有重組質粒的農桿菌去侵染植物根部切口，通過輔助性質粒的Vir區表達蛋白與重組質粒T-DNA區（目的片段）的反式作用激活T-DNA的轉移（此處可參見詞條雙元表達載體系統），從而將目的片段整合到植物細胞基因組中。隨着愈傷組織的形成，使得新生細胞均含有該目的片段的基因。

轉化：目的基因插入Ti質粒的T-DNA上——進入農桿菌——導入植物細胞——目的基因整合到植物染色體的DNA上——目的基因得以穩定維持和表達

1、獲取目的基因：用限制性核酸內切酶切割下目的基因。

2、基因表達載體的構建：將目的基因與載體（大多數選用質粒）用DNA連接酶連接起來。

3、將目的基因導入受體細胞：將含目的基因的重組質粒導入農桿菌（農桿菌為受體細胞）。

4、目的基因的檢測與鑑定：用DNA分子雜交技術/分子雜交技術/抗原-抗體雜交/個體生物學水平鑑定（這個方法需要導入重組後的細胞的植物體，詳見第五步） 幾種方法進行檢驗（根據要求選取不同方法）。

5、最後將成功表達的細胞導入植物體內，對植物體進行個體生物學水平鑑定。

整個轉基因體系的建立步驟大致可以歸納為：目的載體的構建---載體的農桿菌轉化---農桿菌與植株共培養---轉化植株的篩選---轉化植株的鑑定。

在每一步中都涉及到很多的方法與技術。目的載體的構建，包括目的基因的克隆、載體的酶切、連接（用限制性核酸內切酶與DNA連接酶），以及測序分析。載體的農桿菌轉化，目前有很成熟的方法，試驗中應注意熱激和冷激的時間。農桿菌與植株的共培養，即為植株轉化實驗，在溶液中加入促進植株愈傷生長的激素能一定程度提高轉化率。轉化植株的篩選，大多是利用抗生素進行篩選的，抗生素的選擇則需根據目的載體確定，設置不同梯度的抗生素對植株進行篩選。轉化植株的鑑定，一般採用PCR法。以上所有的操作，都應該在無菌環境下進行，無菌是植物組培的一項基本，但是重要的要素。

農桿菌Ti質粒轉化系統與其他基因轉化體系相比，具有許多突出的優點：①該轉化體系是模仿或稱之為利用天然的轉化載體系統，成功率高，效果好；

②農桿菌Ti質粒轉化系統的機理研究得最清楚，方法最成熟，應用也最廣泛；

③農桿菌Ti質粒轉化系統轉化的外源基因以單拷貝為多數，遺傳穩定性好，並且多數符合孟德爾遺傳規律，因此轉基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料；

④農桿菌Ti質粒轉化系統操作比較容易，需要的儀器設備簡單，易於推廣。

農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力。當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌移向這些細胞，這時農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）可轉移至受體細胞，並且整合到受體細胞染色體的DNA上。根據農桿菌的這種特點，如果將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，並將其插入到植物細胞中染色體的DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達。它是將目的基因導入植物細胞採用最多的方法。