-
色譜分離技術
鎖定
- 中文名
- 色譜分離技術
- 又 稱
- 層析分離技術或色層分離技術
- 概 念
- 分離複雜混合物各個組分有效方法
- 目 的
- 從而使各物質達到分離
色譜分離技術色譜種類
吸附色譜法是指混合物隨流動相通過吸附劑(固定相)時,由於吸附劑對不同物質具有不同的吸附力而使混合物中各組分分離的方法。此法特別適用於脂溶性成分的分離。被分離的物質與吸附劑、洗脱劑共同構成吸附層析的三要素,彼此緊密相連。
色譜分離技術常用吸附劑
常用的極性吸附劑有:硅膠、氧化鋁。硅膠顯弱酸性,適於分離酸性和中性化合物,分離生物鹼時需在流動相中加入適量的有機鹼;氧化鋁呈鹼性,適於分離生物鹼等鹼性成分,不宜用於分離有機酸等酸性成分。極性吸附劑的吸附作用有以下特點。
1.被分離物質極性越強,吸附力越強。強極性溶質將優先被吸附。
2.溶劑極性越弱,則吸附劑對溶質的吸附能力越強。隨溶劑極性的增強,則吸附劑對溶質的吸附力將減弱。
3.當加入極性較強的溶劑後,先前被硅膠或氧化鋁所吸附的溶質可被置換而洗脱出來。
活性炭是常用的非極性吸附劑。活性炭對非極性物質具有較強的親和力,在水中對溶質表現出強的吸附能力。從活性炭上洗脱被吸附的物質時,溶劑的極性越小,洗脱能力越強。一般化合物的極性按下列官能團的順序增強:—CH2—CH2—,—CH==CH—,—OCH3,—COOR,>C==O,—CHO,—NH2,—OH,—COOH。
色譜分離技術色譜分離方法
一、凝膠過濾
二、離子交換色譜
離子交換色譜是在以離子交換劑為固定相,液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行,或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。
三、吸附色譜
1、 吸附柱色譜
2、 薄層色譜
3、 聚酰胺薄膜色譜
聚酰胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。色譜時,展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚酰胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程,就能導致分離物質達到分離目的。
四、 親和色譜
親和色譜的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似,每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中,特異的廢物(S'')才能和一定的酶(E)結合,產生複合物(E-S'')一樣。在親和色譜中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力,併產生複合物。而親和色譜與酶一底物反應不同的是,前者進行反應時,配體(類似底物)是固相存在;後者進行反應時,底物呈液相存在。實質上親和色譜是把具有識別能力的配體L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上,製成親和吸附劑M-L,或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。
因此,當把圍相載體裝入小色譜柱(幾毫升到幾十毫升牀體積)後,讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、範德瓦爾力,以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上,而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩衝液洗滌出來,並形成了第一個色譜峯。然後,恰當地改變起始緩衝 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子,即可把物質S從固相載體上解離下來,並形成了第M個色譜峯(見圖6-2)。顯然,通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時,採用選擇性緩衝液進行洗脱,也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後,可以重複使用。
上面介紹的親和色譜法也是特異性配體親和色譜法。另外還有通用性配體親和色譜法。這兩種親和色譜法相比,前者的配體一般為複雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等),它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料,以及氨基酸等),它成本低廉、具有較高的吸附容量,通過改善吸附和脱附條件可提高色譜的分辨率。
五、聚焦色譜
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換色譜中,PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如,當使用陰離子 劑進行色譜時,製備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是,在梯度儀的混合室(這色譜柱者)中裝高PH溶液,而在另一室裝低PH極限溶液,然後打開色譜柱的下端出口,讓洗脱液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦色譜中,當洗脱液流進多緩衝交換劑時,由於交換劑帶具有緩衝能力的電荷基團,故PH梯度溶液可以自動形成。
2.蛋白質的行為