嗜肝DNA病毒科

正嗜肝DNA病毒屬

〓(一)〓土撥鼠肝炎病毒(WHV)

〓(二)〓地松鼠肝炎病毒(GSHV)

〓(三)〓樹松鼠肝炎病毒(TSHV)

禽嗜肝DNA病毒屬

〓(一)〓鴨乙型肝炎病毒(DHBV)

〓(二)〓蒼鷺乙型肝炎病毒(HHBV)

人們認識到肝炎是一種傳染病可以追溯至很久以前，但直到60年代後期，才弄清乙型肝炎病

毒(HBV)是傳染性肝炎的一個重要病因。最直接的貢獻來自於Dane等(1970)的研究，他們在

肝炎病人的血液中發現了42～47nm的病毒粒子(後來稱這種具有傳染性的病毒顆粒為Dane顆粒)，即完整的病毒粒子；同時還有Robinson及其同事的一系列創新性工作。隨後的十年中

，HBV結構和生物學鑑定的研究進展迅速。然而由於該病毒宿主範圍狹窄，又不能在培養的

細胞中增殖，嚴重阻礙了早期對病毒複製生物學的研究進程。在過去的十幾年裏，HBV感染

動物模型的建立以及分子遺傳學的誕生，尤其是HBV基因組克隆的成功，用克隆的HBVDNA可

以進行體外轉染試驗，使人們對HBV有了更清楚的瞭解。



嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)下設2個屬：正嗜肝DNA病毒屬和禽嗜肝DNA病毒屬。前者代

表種為人乙型肝炎病毒(HBV)，其它已確定的成員有土撥鼠肝炎病毒(WHV)、地松

鼠肝炎病毒(GSHV)和樹松鼠肝炎病毒(TSHV)；後者的代表種為鴨乙型肝炎病毒(DHBV)，同時

包括蒼鷺乙型肝炎病毒(HHBV)。近年來，在牛、馬、羊、豬、雞等多種動物體內檢測到與嗜

肝DNA病毒相關性抗原或類似的病毒粒子，但均未正式確定為獨立的病毒種。本科病毒間具

有相似的病毒粒子結構和嗜肝特性以及明確的種屬特異性。該科病毒與其它已知病毒科病毒

的主要不同點，包括具有部分單鏈的雙鏈DNA基因組、過量顆粒性囊膜抗原分泌到宿主血液

中以及由反轉錄酶參與形成病毒粒子的獨特複製機理等方面。

嗜肝DNA病毒完整的病毒粒子呈球型，直徑40～49nm(禽嗜肝DNA病毒為45～65nm)。它由囊膜和核衣殼組成，外面的囊膜厚7nm，無表面突起；內部核衣殼呈二十面體對稱，直徑27～35nm(禽嗜肝DNA病毒為35～40nm)，有180個殼粒，以T=3對稱排列。在感染動物血清中還可見到無核酸的22nm左右的脂蛋白球型或纖維狀顆粒。

嗜肝DNA病毒核酸為具有部分單鏈和部分雙鏈的非共價閉合環狀DNA分子，病毒粒子的分子量約為16×103～18×103kDa，沉降係數約15S；G+C含量48%。其中一條鏈(負鏈，與mRNA互補)具有全長序列(30～33kb)，另一條鏈(正鏈)長17～28kb不等，完全雙鏈的克隆的DNA約32kb。長(負)鏈具有一個242bp缺口(在禽嗜肝DNA病毒為50bp)，其位置起始於短(正)鏈的5'端，兩條鏈的5'端重疊240bp，通過粘端鹼基配對保持DNA的環狀構型。長鏈5'端具有共價結合的末端蛋白，病毒粒子核心具有DNA聚合酶/反轉錄酶，該酶利用

短鏈DNA的3'端作為引物修復單鏈區以形成全長的雙鏈分子。

HBV病毒基因組有4個重疊或部

分重迭的開放閲讀框架(ORF)，它們均在長(負)鏈上，方向相同。一個ORF(S基因)編碼主要的表面抗原(HBsAg)多肽(24kDa)，該基因前有一個“前S區”，帶2個框內起始密碼，它們是較少的33kDa和39kDaHBsAg多肽的起始位點。第二個ORF(C基因)編碼主要的核心抗原(HBcAg)多肽(22kDa或21kDa)，該基因前有一“前C區”，編碼29個氨基酸(aa)。最長的ORF(P基因)佔整個基因組的80%，與其它三個ORF重疊，它編碼反轉錄酶、病毒DNA聚合酶和RNaseH以及連接於基因組的末端蛋白。第四個ORF稱為X基因，在體外轉染試驗中呈現反式作用活性，但自然感染中的作用尚不清楚。已知的WHV和GSHV均具有上述4個ORF，至少在WHV和GSHV，X基因對於病

毒複製是必需的。DHBV缺乏X基因。

S蛋白、M蛋白和L蛋白。病毒核心含有一種主要蛋白，P22或P21。2種主要S多肽分別為P24和GP27，它們的氨

基酸組成相同，差別於GP27為糖基化的。M蛋白GP33和GP36由P24和N端另外55個氨基酸組成，差異在於糖基化的程度，它們具有“前S2”結構域。L蛋白P39和GP42比M蛋白再多出120個氨基酸，差異在於前者未糖基化，後者糖基化了，兩者具有“前S1”和“前S2”結構域。嗜肝DNA病毒的特異性酶類包括蛋白激酶、依賴RNA的和依賴DNA的DNA聚合酶、RNaseH，以及共價結合到全長DNA鏈5'端的末端蛋白，可能起引發酶的作用。

在表面抗原顆粒和完整病毒粒子中，它們可能來源於宿主細胞的粗麪內質網，包括磷脂、固醇和脂肪酸。嗜肝DNA病毒的糖類成分主要是病毒囊膜中存在的N聚糖和甘露糖。HBV主要有3種抗原:分別為HBsAg、HBcAg和HBeAg。HBsAg與中和性作用有關。HBsAg與WHV和GSHV的類似抗原(WHsAg和GSHsAg)間呈現一定的交叉反應，但與DHBV的類似抗原(DHBsAg)間無交叉反應。HBcAg為病毒核心的主要抗原。HBeAg是在病毒複製活躍時的宿主血清中檢測到的一種可溶性蛋白(抗原)，它與HBcAg的大部分氨基酸序列相同，其羧基末端的149aa與HBcAg氨基末端相同，因此兩者具有共同的抗原決定簇，但由於兩者的氨基末端(HBeAg)和羧基末端(HBcAg)分別多出一段氨基酸序列，彼此又各有不同的抗原決定簇。HBcAg與WHV和GSHV的相應抗原(WHcAg和GSHcAg)的交叉反應比表面抗原間的交叉反應強。

主要的RNA轉錄體，分別為34kb、24kb和21kb，它們具有不同的5'端(均有帽結構)和相似的3'端，最短的轉錄體(21kb)起始於前S區中段，比基因組還長的轉錄體(34kb)起始位點靠近C基因起始密碼處。21kbmRNA和24kbmRNA似乎僅發現於表達HBsAg的細胞中，3種轉錄體均出現於支持病毒複製的細胞內。P39或GP42由24kbmRNA翻譯產生，GP33或GP36由21kbmRNA翻譯產生，P24或GP27由21kbmRNA和其它可能的2kb左右的mRNA翻譯產生，C抗原由34kbmRNA翻譯產生。其它嗜肝DNA病毒也具有類似的幾種轉錄體。嗜肝DNA病毒的複製包括幾個獨特的步驟：產生共價閉合環狀DNA分子(cccDNA)；合成較大的正鏈RNA(34kb)，包裝入病毒核心顆粒中作為負鏈DNA合成的模板(反轉錄)；RNaseH酶切直接重複序列DR1和DR2後，存留的正鏈DNA5'端的轉位作用引發以負鏈DNA為模板合成正鏈DNA。裝配成成熟病毒粒子後，由細胞中釋放出來。完整的HBV粒子和空心的HBV核衣殼的成熟部位似乎為感染肝細胞的核和胞漿。HBsAg僅在胞漿中和胞膜上檢測到，但HBV成熟的確切機理尚缺乏可靠的證據。

嗜肝DNA病毒呈現高度宿主特異性，例如，已知道HBV的宿主是人，但黑猩猩和長臂猿可經實驗感染。DHBV主要感染北京鴨，也可實驗感染野鴨，但雞和鵝等其它家禽對DHBV不敏感。嗜肝DNA病毒可存活於那些與感染者粘膜或皮膚創口接觸的物品表面，如醫療、實驗器材等。儘管曾有報道某些蚊蟲和臭蟲含有HBsAg，但尚無有關經昆蟲載體傳播的直接證據。

〖BT2〗二、正嗜肝DNA病毒屬(Orthohepadnavirus)

正嗜肝DNA病毒包括所有哺乳動物嗜肝DNA病毒。其代表種是人乙型肝炎病毒(HBV)。由於HBV對人類的危害十分嚴重,對其研究已經非常細緻。事實上，有關嗜肝DNA病毒的資料大多數來自於對HBV的研究。已經明確的正嗜肝DNA病毒屬的動物病毒成員包括土撥鼠肝炎病毒(WHV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)。此外還有關於樹松鼠肝炎病毒(TSHV)的報道。

〖BT(3〗(一)〓土撥鼠肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus)〖BT)〗

60至70年代,在美國費城動物園的一個土撥鼠(Marmotamonax)羣中流行着一種類似人乙型肝炎的疾病。1977年5月，在該羣的102例屍檢的土撥鼠中發現23例原發性肝癌，平均59月齡(23～106月齡)。肝臟的典型特徵為肝實質門區和竇狀隙炎性細胞浸潤，膽管、膽小管增生，肝細胞變性、壞死，並出現各種類型的炎性細胞。

檢測這些土撥鼠血清證實15%具有含DNA聚合酶的HBV樣顆粒。這是土撥鼠肝炎病毒(WHV)的首次報道。在隨後的調查中，發現土撥鼠中WHV的感染率極高。1978～1979年間在賓夕法尼亞東南部、新澤西中部和馬里蘭中北部捕獲的217只土撥鼠中，WHV感染率分別為1978：7/51(137%)；1979：28/166(169%)。同時發現1979年捕獲的166只土撥鼠中49只具有WHV抗體(295%)。

〖BT4〗1.形態特徵WHV是繼HBV後發現的第一個哺乳動物嗜肝DNA病毒，其形態特徵與HBV十分相似。電鏡可見3種不同的顆粒：一種為40～50nm的雙層膜顆粒，它是完整的病毒粒子，相當於HBV的Dane顆粒；另一種為直徑20～22nm的球形顆粒；第三種為直徑20～22nm、長短不一的絲狀顆粒。完整病毒粒子平均CsCl浮密度1215g/cm另外有一個浮密度為1196g/cm的主要蛋白峯。

〖BT4〗2.理化學特性克隆的WHV基因組DNA約33kb，與HBV的核苷酸序列同源性為70%。SDSPAGE分析表明，WHV表面抗原(WHsAg)有6種成分，分子量分別為22、25、35、37、39和42kDa。在慢性感染的土撥鼠肝臟中可檢測到2個主要轉錄體，分別為21kb和37kb。21kbmRNA為S基因的主要轉錄體，編碼WHsAg；37kbmRNA比WHV基因組DNA略大，可參與WHV所有蛋白質的表達，可編碼WHV核心抗原(WHcAg)，同時作為反轉錄的模板，為前基因組RNA。

〖BT4〗3.培養特性免疫組織化學和超微結構分析WHV感染的土撥鼠肝組織發現WHsAg以微粒或包涵體形式存在於肝細胞漿中,WHsAg陽性細胞分佈於肝小葉周圍區。WHcAg主要位於細胞漿中，而不存在於核內(與HBcAg不同)。電鏡檢查提示在粗麪內質網中有許多絲狀結構(直徑18～20nm)，無囊膜的核心顆粒(直徑18～20nm)僅見於胞漿中。有囊膜的顆粒(直徑42～45nm)見於粗麪內質網腔內，它們與血清中見到的顆粒在形態上相同。這表明WHsAg主要在肝細胞漿中產生，並且似乎迅速裝配成病毒粒子。由WHV感染的土撥鼠分離的外周血淋巴細胞帶有低水平的非複製型WHVDNA。當這樣的細胞以脂多糖(LPS)活化時，可誘導細胞中WHVDNA複製，3天后出現WHV核心顆粒，含有WHVDNA複製中間體、RNA/DNA雜交分子及活化的內源性DNA聚合酶。LPS誘導5～7天可見成熟病毒粒子釋放到培養液中。這為循環淋巴細胞的慢性WHV感染可重新活化提供了線索。用這樣培養的WHV粒子對成年土撥鼠進行接種試驗，結果發現注射後8～10周可檢測到急性感染的血清學指標，並可引起急性肝炎。

WHV呈現明顯的組織嗜性，對實驗感染WHV15個月後的土撥鼠(包括慢性感染者和急性感染血清學恢復者)的10種組織(外周血淋巴細胞、淋巴結、脾臟、骨髓、胸腺、胰腺、腎臟、卵巢、睾丸和肝臟)進行核酸分析，發現每隻土撥鼠都有幾種組織存在WHV核酸。不同組織和動物個體在WHV核酸出現的頻度、水平以及組織分佈和病毒基因組形式上都有差異。肝臟中含有最多的病毒。WHVDNA複製僅見於慢性感染土撥鼠的肝臟和脾臟內，脾臟是所有肝外器官中含有部分雙鏈病毒基因組最多的器官。康復動物的任何組織均未發現複製型WHVDNA。WHVDNA在慢性攜帶者的肝細胞中分佈是均勻的，相反，在肝外組織以及康復動物的肝臟，僅見於分散的細胞灶中。在另一項研究中，對肝臟和5種主要淋巴器官(外周血淋巴細胞、淋巴結、骨髓、脾臟和胸腺)進行了檢測，在65周內的不同時期將實驗感染的土撥鼠剖殺，發現WHV感染並不限於肝臟，而且發生於淋巴系統的主要器官。最先檢測到WHVDNA的細胞是骨髓中的淋巴細胞，其次是肝臟、脾臟、外周血淋巴細胞、淋巴結，最後是胸腺。1989年，Aldrich等證明土撥鼠原代肝細胞對WHV和GSHV體外感染是敏感的，可產生特異性病毒DNA。蘇拉滅、聚凝膠(polybrene)或ddCTP可阻斷WHV的感染，感染後2天可檢測到cccDNA，它是病毒RNA轉錄的模板。直到感染後7～10天還幾乎檢測不到病毒複製中間體，但在以後的幾週中，這種病毒DNA中間體迅速增加。

〖BT4〗4.抗原性1983年，Cote和Gerin利用單克隆抗體競爭結合試驗鑑別了WHsAg的5個獨立的抗原結合位點(Ⅰ～Ⅴ)，其中位點Ⅰ為WHsAg、GHsAg和HBsAg所共有。至少位點Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ為WHsAg和GHsAg共有，而位點Ⅳ和Ⅴ為WHsAg特異性位點，5個位點與DHBsAg間無任何交叉反應。

WHsAg和HBsAg間呈現弱交叉反應，這種交叉反應在保護性免疫中表現出單向性，即WHsAg免疫可保護猩猩抵抗HBV感染，而HBsAg免疫卻不能保護土撥鼠抵抗WHV感染。利用WHsAg免疫2只猩猩誘導產生了HBsAg交叉保護性抗體，經HBV攻擊後，一隻猩猩完全得到保護，而另一隻猩猩呈現亞臨牀感染，無肝病症狀。用HBsAg免疫3只土撥鼠誘導產生了抗HBs，與WHsAg呈交叉反應，但在用WHV攻擊後，3只土撥鼠均發生了典型的急性感染，並伴發肝損傷。利用HBeAg抗HBe試劑也可檢測到抗HBe陽性，説明在感染的土撥鼠中存在WHeAg抗WHe系統。

利用免疫擴散試驗可區分WHsAg和WHeAg，經超速離心和硫酸銨沉澱可將兩者分開。利用WHeAg加強免疫後，經放射免疫測定(RIA)檢測到抗HBe應答，進一步肯定了存在與HBeAg交叉反應的可溶性WHeAg。有人曾在WHsAg陽性土撥鼠中檢測到抗x抗體陽性(17/40)，多數土撥鼠(14/17)的抗x抗體出現於病毒DNA在血清中消失時或之後，説明抗x抗體是WHV感染的標誌，且與病毒複製減弱有關。抗x抗體可能為宿主抗病毒複製複合物的應答。

〖BT4〗5.病原性在自然感染的土撥鼠中曾發現嚴重的慢性肝炎和肝細胞癌病例。利用新生土撥鼠實驗感染已證明WHV感染與腫瘤存在一定相關性。用WHV陽性血清進行土撥鼠實驗感染，可引發急性肝炎，肝損傷類似於HBV感染猩猩和人的肝損傷，肝臟中的小壞死灶與淋巴細胞、巨噬細胞以及少量中性粒細胞和漿細胞的聚集有關。WHV引起的肝炎分為兩種情況：(1)肝門區肝炎，WHcAg聚集於細胞漿，而WHsAg位於肝細胞膜上；(2)門靜脈周圍肝炎，WHcAg位於核內，WHsAg主要分佈於細胞漿中。由肝門區向門靜脈周圍擴散似乎是因抗WHV免疫應答的部分恢復不足以抑制病毒複製而引起的。在重症肝炎時，可見到腎臟、脾臟中WHsAg和免疫球蛋白的沉積。1985年，Roth等分析了16個自然慢性感染WHV的土撥鼠的肝臟，發現15個具有慢性肝炎特徵，其中10個呈現慢性活動性肝炎，4個為慢性持續性肝炎，1個為肝硬化伴有結節性再生。

1992年，Peters等在對705只土撥鼠的病理材料進行回顧性分析中，發現26只有腎小球損傷，組織學和免疫組織化學檢測表明有6只存在免疫介導的腎小球腎炎。6只土撥鼠均為WHV攜帶者，3只患腎小球腎炎，其中2只還有腎小球基底膜增生。這3只土撥鼠的腎小管基底膜上存在宿主免疫球蛋白，其中2只的腎小管周圍有WHcAg。

所有3只土撥鼠腎小球內均含WHcAg。WHsAg的沉積情況類似於WHcAg，不同的是僅見於混合型腎炎的土撥鼠毛細管襻周圍。其它3只土撥鼠發生腎小管基底膜增生，WHsAg和宿主免疫球蛋白主要沉積於腎小管基底膜，未檢測

到WHcAg。

透射電鏡分析表明腎小管基底膜增厚，所有6只土撥鼠的腎小管基底膜均有電子緻密沉積物

。

〖BT4〗6.傳播與分佈

土撥鼠為WHV的自然宿主。該病毒最先發現於北美洲土撥鼠中，1988年，Jin等報道了中國土撥鼠可實驗感染WHV，説明不同品種的土撥鼠均可感染。雌性土撥鼠比雄性土撥鼠更易感。不同地區的土撥鼠感染率不同。對WHV流行羣體出生的新生土撥鼠和胎鼠檢查表明，WHV可垂直感染。

〖BT4〗7.免疫WHV的4個ORF編碼的蛋白質均可誘導產生抗體，但似乎抗表面抗原的抗體為保護性抗體。1993年，Schodel等利用重組WHcAg和HBcAg免疫土撥鼠，然後以WHV攻擊，結果發現6只HBcAg免疫土撥鼠中有4只抵抗感染。兩種抗原免疫的土撥鼠均產生了高滴度的相應抗體，但兩種抗體的交叉反應性極低(小於10%)。由於WHcAg和HBcAg顆粒上的主要B細胞表位不是保守的，上述研究結果也表明抗HBcAg/WHcAg抗體應答在保護作用中不是重要的。以WHcAg/HBcAg免疫的土撥鼠在用WHV攻擊後表現出快速抗病毒囊膜蛋白的抗血清應答，表明功能性結構內/分子間的T細胞輔助作用是用內部病毒抗原免疫後的一種可能的保護機理。尚無商品疫苗供WHV感染的免疫預防。

〖BT4〗8.診斷由於WHV與HBV間存在一定的同源性，對於一個土撥鼠羣是否感染的診斷可借用商品HBV診斷試劑；此外，還有幾種方法可用於檢測WHV的感染。

(1)放射免疫測定法(RIA)〓可用於檢測WHsAg和抗WHs抗體。均採用125I標記的WHsAg。檢測抗體時，以純化的WHsAg包被聚苯乙烯微孔板，加入待檢血清樣本，經温育後，再加入125I標記的WHsAg，最後進行γ計數，以正常血清作為陰性對照，計算樣本與陰性對照比率，以大於或等於210作為陽性標準。檢測抗原時，在上述包被板孔中加入標準抗WHBs抗體(S/N=10)，温育後，依次加入待檢樣本、125I標記的WHsAg，以N/S比率作為判定標準，測定樣本中WHsAg與125I標記的WHsAg的競爭性結合又稱RIA阻斷法。該法可檢測

到10ng/ml的WHsAg。此外還有檢測WHcAg和抗WHc抗體的放射免疫測定法。

(2)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)〓採用夾心法和間接法可測定WHsAg和抗WHs抗體。

(3)免疫吸附血凝試驗〓僅用於檢測WHsAg，不能檢測抗WHs抗體。

〖BT4〗9.治療

由於土撥鼠和WHV是研究人HBV感染治療的動物模型，人們在WHV感染方面做了一些試驗。1989年，Blumberg等報道利用苦葉下珠(Phyllanthusamarus)抽提物對WHV感染的土撥鼠的實驗治療研究，發現4只新感染的土撥鼠中有3只清除了體內病毒，而感染3個月以上的土撥鼠經治療後體內病毒水平下降。該作者已將活性組分進行了分離和鑑定。OxetanocinG(OXTG)是由Bacillusmegaterin的培養濾液中分離出的新核苷，一種有潛力的抗病毒劑。1994年，Ikeda等研究了口服OXT

G對WHV感染的抵抗作用。發現應用OXTG後，土撥鼠血清WHVDNA水平顯著下降，但停止使用OXTG後，血清WHVDNA水平又回升。經治療後的土撥鼠肝臟中WHV複製型中間體減少。

〖BT(3〗(二)〓地松鼠肝炎病毒(Groundsquirrelhepatitisvirus)〖BT)〗

1980年，Marion等報道在美國加利福尼亞北部地區的健康Beechy地松鼠中發現了具有HBV和WHV特徵的病毒，即地松鼠肝炎病毒(GSHV)。

〖BT4〗1.形態特徵

GSHV病毒粒子的直徑比HBV略大，約47nm，具有厚7nm的外部囊膜和內部球形核心。在GSHV感染動物血清中也見到三種類型的顆粒，其突出特點是球形表面抗原顆粒直徑15～25nm，含量最少，而纖維狀表面抗原顆粒直徑20～25nm，長度可達750nm（是HBV纖維狀顆粒的3倍），這種顆粒含量最多。〖BT4〗2.理化學特性GSHV基因組大小與HBV相近，約32kb～33kb。DNA具有一個PvuⅡ位點和2個EcoRⅠ位點，這一點與HBV不同。由血清分離的球形顆粒含有23kDa和27kDa兩種多肽。在SDSPAGE分析中比HBsAg顆粒的2種主要多肽遷移率快

。GSHV和WHV表面抗原多肽具有相似的肽圖。根據DNA推測的蛋白質間同源性，GSHV與WHV之間為78%，GSHV與HBV間為43%。GSHV有2種主要轉錄體，分別為23kb和35kb，它們都是未剪接的。具有相同的多聚腺苷酸尾。23kbmRNA編碼主要表面抗原(S)多肽和前表面抗原(preS)多肽；35kbmRNA編碼核心抗原(C)，同時有些分子可作為前基因組RNA。利用NP40處理可顯著降低GSHV的感染性。

〖BT4〗3.抗原性GSHV與HBV的表面抗原間交叉反應微弱，而與DHBV的表面抗原間無交叉反應。在GSHV感染中也存在類似於HBeAg抗HBe和HBcAg抗HBc那樣的抗原抗體系統，因為用HBcAg和HBeAg試劑能檢測到相應的抗體。GSHV與WHV的表面抗原間呈現明顯的交叉反應，但用單克隆抗體可以檢測到兩者間的差異。因為GSHV同HBV和WHV一樣有4個開放閲讀框架(ORF)，推測在GSHV感染中也存在x蛋白和抗x抗體，而且x蛋白對於GSHV的感染是必需的．

〖BT4〗4.病原性

GSHV最初分離自健康地松鼠體內，雖然也有少量關於GSHV攜帶者發生肝癌的報道，但僅見於持續感染較長時間（4歲以上）後。其致癌性明顯比WHV弱，而且WHV引起肝癌時間明顯早於GSHV。有人用自然感染的地松鼠血清接種敏感的地松鼠，60%的動物在2～3個月後發生GSHsAg抗原血癥，少數動物持續病毒血症達9個月之久。GSV也表現出強嗜肝特性，在感染動物肝臟中可檢測到病毒DNA。然而急性感染後肝損傷不明顯。克隆的GSHVDNA經

肝內接種具有感染性，表現出與接種GSHV病毒粒子相似的特徵，但經靜脈注射無感染性。

〖BT4〗5.傳播與分佈

GSHV的自然宿主是地松鼠，不同品種的地松鼠均可感染，GSHV不能感染親緣關係相近的松鼠，但金花鼠（Chipmunk）可經GSHV病毒粒子或克隆的GSHVDNA實驗感染。經非腸道途徑接種大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠等實驗動物均不能引起感染。GSHV的感染無性別差異，但存在地區性，在分別距離感染羣70英里和300英里的2個地松鼠羣中未發現感染者。

〖BT(3〗(三)〓樹松鼠肝炎病毒(Treesquirrelhepatitisvirus)〖BT)〗

樹松鼠肝炎病毒(TSHV)首先發現於美國賓夕法尼亞Reeding附近捕獲的樹松鼠(Sciuruscarolinensispennssylvanicus)。1986年，Feitelson等用檢測HBV血清學標誌的試劑對94只樹松鼠血清進行檢測，未發現一例陽性，但純化的HBsAg或HBcAg與樹松鼠系列稀釋血清反應時，證明許多具有抗HBs和抗HBc交叉反應性抗體。組織學檢查表明14只動物呈現明顯的彌散性壞死灶、門靜脈周圍浸潤、膽管周圍炎和/或膽管增生等與病毒性肝炎相一致的變化。其中3只樹松鼠體內的病毒DNA聚合酶活性呈陽性。經密度梯度離心純化的抗原顆粒大小為21～35nm，平均25nm，類似於球形HBsAg或HBcAg顆粒，但未見到成熟病毒粒子。將TSHV相關性顆粒進行SDSPAGE分析，觀察到2個主要蛋白條帶，分別為155kDa(p155)和17kDa(p17)，某些凝膠上還有另一個主條帶，145kDa(p145)。隨後的肽圖分析表明這三種主要成分與HBV、WHV和GSHV的主要表面抗原密切相關，説明它們是TSHV的表面抗原相關多肽。在SDSPAGE中還可見到另外3條稀淡的條帶，分別為19kDa(p19)、20kDa(p20)和35kDa(p35)，其中p35可能是HBcAg相關性蛋白質。

〖BT2〗二、禽嗜肝DNA病毒屬(Avihepadnavirus)

禽嗜肝DNA病毒屬的代表種為鴨乙型肝炎病毒(DHBV)，該屬已確定的病毒還包括蒼鷺乙型肝炎病毒(HHBV)，其中DHBV一直作為研究HBV、篩選和驗證中西藥物抗病毒活性的動物病毒模型，通過研究DHBV感染鴨闡明瞭嗜肝DNA病毒的複製過程。

〖BT(3〗(一)〓鴨乙型肝炎病毒(DuckhepatitisBvirus)〖BT)〗〖BT4〗1.形態特徵DHBV成熟病毒粒子直徑45～65nm不等，蔗糖浮密度為115～116g/cm3，病毒表面囊膜厚約10nm，內含直徑35～40nm的核心顆粒。在感染鴨血清中存在45～50nm的多形態顆粒，即為DHBV表面抗原顆粒。〖BT4〗2.理化學特性DHBV基因組DNA約3kb，與HBV的核苷酸序列同源性極低，但推測的氨基酸序列十分相似。DHBV基因組編碼3個ORF，P、S和C，均位於長鏈上，方向相同。該病毒缺乏正嗜肝DNA病毒所擁有的XORF，在感染鴨體內可檢測到3種主要轉錄體，大小分別為35kb、27kb和25kb，其中35kbmRNA可作為反轉錄模板。SDSPAGE分析DHBV囊膜蛋白僅見3個條帶：185kDa、30kDa和385kDa。

〖BT4〗3.培養特性用DHBVDNA轉染人肝細胞系HuH7可暫時性複製病毒，產生類似於感

染動物血清中的病毒粒子，並能再感染鴨原代肝細胞培養物。而DHBVDNA轉染人肝細胞系HepG2後，可產

生和釋放成熟病毒粒子於培養液中，這種培養液接種北京鴨可引起感染，説明人肝細胞可支持禽嗜肝DNA病毒的增殖。Condreay等1990年研究發現禽肝細胞系LMH經DHBVDNA轉染後產生的病毒複製中間體和感染性病毒粒子分別比HuH7和HepG2細胞高5～10倍和10～20倍。Freiman等1988年對1日齡雛鴨進行的感染試驗表明，3日齡時肝細胞中出現DHBVDNA，4日齡時胰腺細胞中出現DHBVDNA，此後血清中(6日齡)、脾臟(7日齡)和腎小球(14日齡)中相繼檢測到DHBVDNA。循環中病毒DNA出現的峯值時間在感染後1～4周。病毒在動物體內的複製時間與肝臟發育形成的時間相吻合，暗示胚胎髮育中出現的某些宿主功能有助於病毒的複製和裝配。1987年Tagawa研究發現鴨胚卵黃囊中的DHBVRNA比肝臟中含量還高。由於卵黃囊與肝臟均是血清蛋白的產生器官，間接證明了宿主功能對病毒複製的影響。用DHBV感染鴨血清接種1～4天的鴨原代肝細胞培養物，2天后可檢測到cccDNA和單鏈DHBVDNA複製中間體。隨着接種時間的延長，細胞內松馳環狀DNA(簡寫為rcDNA，即部分單鏈的雙鏈DNA，經補鏈後成為cccDNA)、cccDNA和單鏈DHBVDNA進一步增加。然而僅1～4天的原代肝細胞對DHBV是敏感的，免疫熒光

檢測表明細胞感染率為10%。有人研究表明如果原代鴨肝細胞在含二甲基亞碸(DMSO)的無血清培養基中培養，對DHBV的敏感性可持續至少2周。DHBV複製時首先在核內形成病毒核心，經核膜孔進入細胞漿後，在內質網中通過出芽方式獲得囊膜，形成成熟病毒粒子。

〖BT4〗4.抗原性

DHBV感染鴨體內可檢測到類似HBV感染人體內的抗原，包括表面抗原(DHBsAg)、核心抗原(DHBcAg)和遊離的e抗原(DHBeAg)，但缺乏x抗原。然而，DHBsAg與哺乳動物的表面抗原(HBsAg、WHsAg和GSHsAg)之間僅有微弱的交叉反應。〖BT4〗5.病原性

在DHBV感染流行地區，可見到病毒相關的各種肝病，包括慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。儘管在肝癌鴨的肝臟中可檢測到整合型DHBVDNA，而且DHBV感染鴨患肝癌的比率明顯高於未感染鴨，表明DHBV與肝癌發生間存在一

定的相關性，但該病毒引起肝癌的確切機理尚不清楚。值得注意的是，DHBV相關性肝癌僅見於我國啓東縣等少數地區，有人報道對DHBV感染鴨進行連續幾年的觀察未發現肝癌，認為肝癌的發生受多種因素的影響。其中年齡是個重要因素，通常商品鴨在2歲以內，而發生肝硬化和肝癌需要較長時間。用DHBV感染鴨血清接種敏感雛鴨或成鴨均可引起持續性感染和高滴度病毒血症，病毒侵及的器官主要是肝臟。利用克隆的DHBVDNA經肝內注射，可引起雛鴨病毒血症，產生與自然感染類似的感染狀態。人工感染實驗表明，DHBV接種時間與發生的感染類型存在相關性，3日齡之前接種引起持續性病毒血症，而3日齡之後接種引起持續性或暫時性病毒血症，且僅發生輕度肝炎。〖BT4〗6.傳播與分佈北京鴨是DHBV的主要宿主，野鴨和櫻桃谷鴨（cherryvalley）也可實驗感染,疣鼻棲鴨（muscovy）、鵝和雞對DHBV不敏感。病毒感染的敏感性隨年齡的增加而降低，雛鴨最易感。DHBV的主要傳播途徑是垂直感染，在感染鴨羣中鴨胚感染率為95%～100%，孵出後成為帶毒者。該病毒感染存在明顯的地區性，我國啓東縣鴨的感染率明顯高於其它地區。1986年Freiman和Cossart曾對澳大利亞3個不同羣北京鴨的DHBV感染情況進行調查，發現一個鴨羣感染率為98/140，而另2個鴨羣(290只)無一例陽性。〖BT4〗7.免疫在低劑量攻擊條件下，新生鴨可產生中和性抗DHBsAg應答，在康復鴨血清中可檢測到抗S蛋白和抗preS蛋白抗體，這種抗體在血清中可持續很久，也有時是暫時的。利用細菌表達的preS抗原免疫成鴨，5～10天后可產生抗preS抗體並表現出明顯的抗DHBV感染保護活性。經肽圖掃描發現5個位點與中和性作用有關。尚無商品疫苗用於DHBV感染的免疫預防。〖BT4〗8.診斷(1)免疫熒光法〓採用固定的組織切片檢測抗DHBc抗體。在實驗感染條件下本法也可檢測DHBs抗體。(2)放射免疫測定法(RIA)〓通過對抗DHBs與DHBsAg反應的抑制作用程度間接檢測抗DHBs抗體應答。(3)斑點DNA雜交法(dotDNAblotting)〓用全基因組DNA為探針，對血樣或肝組織樣本進行雜交，是一種敏感而可靠的方法。(4)斑點酶免疫測定法(dotEIA)〓以硝酸纖維素膜為載體，依次加入被檢血清、抗DHBV免

疫血清、辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌A蛋白(SPA酶標記物)，可檢測樣本中的DHBsAg。依次加入純化的DHBV、被檢血清、SPA酶結合物則可檢測血清中的抗DHBs抗體及效價。該法與DHBV核酸斑點雜交法符合率為942%。(5)免疫膜片測定法(Immunodiscassay)〓這是1993年deWilde和Heijtink建立的半定量測定DHBsAg的方法。將未純化的抗原製品吸附於硝酸纖維素膜片上，用兔抗DHBs抗血清(已經正常鴨血和鴨肝細胞處理去除交叉反應性抗體)檢測膜上的抗原。該法的敏感性可與Westernblot分析法相媲美。可用於檢測血清、肝勻漿和感染細胞

培養物中的DHBsAg。〖BT4〗9.治療蘇拉滅對DHBVDNA聚合酶具有抑制作用，但研究發現，在病毒感

染後即不起作用，這表明它僅起阻斷病毒侵入和脱囊膜的作用。2,3二脱氧嘌呤核苷是DHBV的抑制劑，其中2,3二脱氧鳥苷、2,6二氨基嘌呤、2,3二脱氧核苷(ddDAPR)最為有效。每日2次按10mg/kg肌注ddDAPR可迅速清除持續感染鴨體內的DHBVDNA。此外，2,3二脱氧胞苷對DHBV的體內複製也有抑制作用。無環鳥苷(acyclovir)經口服和靜脈注射均可抑制感染性DHBV病毒粒子的複製和產生，但停止用藥後，病毒聚合酶活性又恢復。當聯合應用無環鳥苷和蘇拉滅時，能持續降低DHBV聚合酶活性。也有人研究中草藥對DHBV的抑制作用，發現S.baiculensisi和P.ternata抽提物呈現一定的效果，IC50（半抑制濃度）分別為125mg/ml和160mg/ml。1995年，王能進等報道用複方乙肝解毒丸(主要由茯苓、線藤、苦蔘、豬苓等中草藥組成)進行實驗感染鴨的治療，治療2個月後，發現藥物治療組的斑點DNA雜交試驗轉陰率可達3404%，明顯高於對照組(789%)。用人肝HuH7細胞轉染試驗進行體外檢測表明，r干擾素對DHBV複製具有抑制作用。聞玉梅等發現1日齡雛鴨感染DHBV後對病毒抗原(DHBsAg和DHBcAg)呈現免疫耐受，檢測不到體液和細胞免疫應答。當用福氏完全佐劑病毒抗原免疫時，不能誘導免疫應答。他們將兔抗DHBs血清與固相基質(金黃色葡萄球菌CowanA株)結合後再與純化的DHBsAg形成複合物，稱為固相基質抗原抗體(SMAA)複合物。用SMAA對免疫耐受的鴨免疫注射3次後，17只試驗鴨中有12只血清DHBV和DHBsAg均被清除，其中8只鴨檢測到低滴度的抗DHBs抗體。

反義核酸抗病毒感染是近年來發展起來的一項新技術。1993年，Offensperger等報道了反義寡脱氧核苷酸在體外原代肝細胞以及鴨體內對DHBV的抑制作用。最有效的反義分子是針對preS區5端的寡脱氧核苷酸，可完全抑制病毒在體外和體內的複製和表達。〖BT(3〗(二)〓蒼鷺乙型肝炎病毒(HeronhepatitisBvirus)〖BT)〗1988年，Sprengel等報道了德國灰色蒼鷺(Ardeacinerea)體內的一種DHBV相關性嗜肝DNA病毒，即蒼鷺乙型肝炎病毒(HHBV)。電鏡下可見血清中有兩種直徑40～60nm的顆粒，與DHBV十分相似，直徑較小的囊膜顆粒明顯多於成熟的病毒粒子。HHBV基因組為具有部分單鏈的雙鏈閉合環狀DNA分子，長約30kb，含3個ORF：preC/C，preS/S和P，同樣缺乏哺乳動物嗜肝DNA病毒所具有的XORF。HHBV的限制性酶切圖與DHBV有很大不同，兩者的核苷酸序列同源性為785%，低於齧齒類動物嗜肝DNA病毒WHV與GSHV間的核苷酸序列同源性(836%)。HHBV具有與DHBV相似的蛋白質組成。HHBV僅感染蒼鷺，不能感染北京鴨。

〖BT2〗參考文獻〖HT6SS〗

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