單核細胞增生李斯特氏菌

李斯特氏菌是1926年英國南非裔科學家穆裏在病死的兔子體內首次發現的。為紀念近代消毒手術之父、英國生理學家約瑟夫·李斯特（1827-1912），1940年，在第三屆國際微生物學大會上將其命名為李斯特氏菌。 ^[3] 

國際上公認的李斯特菌共有以下七個菌株：單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、綿羊李斯特菌（Listeria iuanuii）、英諾克李斯特菌（Listeria innocua）、威爾斯李斯特菌（Listeria welshimeri）、西爾李斯特菌（Listeria seeligeri）、格雷李斯特菌（Listeria grayi）、默裏李斯特菌（Listeria murrayi）。其中，單核細胞增生李斯特氏菌是唯一能夠引起人類疾病的，它是一種人畜共患病的病原菌，中毒嚴重的可引起血液和腦組織感染。單核細胞增生李斯特氏菌簡稱單增李斯特氏菌，為革蘭陽性菌，屬厚壁菌門。 ^[3] 

根據菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原，將單增李斯特氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 個血清型。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b，後兩型尤多。該菌與多種革蘭陽性菌有共同抗原，故血清學診斷無意義。 ^[3] 

本菌的抗原結構與毒力無關，且本菌與葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌等多數革蘭氏陽性菌和大腸桿菌有共同抗原，故血清學診斷無意義。 ^[1] 

該菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小約為0.5μmх1.0-2.0μm，直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無芽胞，一般不形成莢膜，但在營養豐富的環境中可形成莢膜，在陳舊培養中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。 ^[2] 

幼齡培養物為革蘭氏陽性，陳舊培養物可轉為革蘭氏陰性，呈兩極着色，易誤認為雙球菌。 ^[1] 

該菌營養要求不高，在20-25℃培養有動力，穿刺培養2-5天可見倒立傘狀生長，肉湯培養物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。該菌的生長範圍為2-42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培養温度為35--37℃，在pH中性至弱鹼性（pH9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，在pH3.8-4.4能緩慢生長，在6.5% NaCl 肉湯中生長良好。在固體培養基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨着菌落的增大，變得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養後可產生窄小的β-溶血環。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂（TSAYE）和改良Mc Bride（MMA）瓊脂上，用45角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。 ^[2] 

該菌觸酶陽性，氧化酶陰性，能發酵多種糖類，產酸不產氣，如發酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側金盞花醇、棉子糖、衞矛醇和纖維二糖，不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。 ^[2] 

該菌對理化因素抵抗力較強，在土壤、糞便、青儲飼料和乾草內能長期存活，對鹼和鹽抵抗力強，60-70℃經5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min 可殺死此菌。該菌對青黴素、氨苄青黴素、四環素、磺胺均敏感。 ^[2] 

單增李斯特氏菌廣泛存在於自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，該菌在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲飼料、爛菜中均有存在，所以動物很容易食入該菌。 ^[3] 

對於單核細胞增生李斯特氏菌的變異性尚未有確鑿證據資料可以證實。 ^[3] 

單增李斯特氏菌廣泛存在於自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，並通過口腔-糞便的途徑進行傳播。據報道，健康人糞便中單增李斯特氏菌的攜帶率為0.6-16%，有70%的人可短期帶菌，4-8%的水產品、5-10%的奶及其產品、30%以上的肉製品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、捲心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約佔85-90%的病例是由被污染的食品引起的。 ^[2] 

單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李氏特菌病，感染後主要表現為敗血症、腦膜炎和單核細胞增多症。 ^[3] 

單增李斯特菌一般導致腸道感染，通常潛伏期為8～48小時。患者會出現發熱、肌肉痠疼、噁心、嘔吐等症狀，幾天即可痊癒。它也能入侵神經系統和循環系統，潛伏長達2～12周，引起嚴重的腦膜炎和敗血症，發病率雖低，病死率卻較高。 ^[5] 

單增李斯特氏菌進入人體後是否發病，與菌的毒力和宿主的年齡、免疫狀態有關，因為該菌是一種細胞內寄生菌，宿主對它的清除主要靠細胞免疫功能。因此，易感者為新生兒、孕婦及40歲以上的成人，此外，酗酒者、免疫系統損傷或缺陷者、接受免疫抑制劑和皮質激素治療的患者及器官移植者也易被該菌感染。該病的臨牀表現，健康成人個體出現輕微類似流感症狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結膜炎、發熱、抽搐、昏迷、自然流產、腦膜炎、敗血症直至死亡。 ^[2] 

該菌可通過眼及破損皮膚、粘膜進入體內而造成感染，孕婦感染後通過胎盤或產道感染胎兒或新生兒，棲居於陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有上升趨勢。 ^[2] 

單核細胞增生李斯特氏菌的毒力因子主要有李斯特溶血毒素、肌動蛋白聚合蛋白、C型磷脂酶、內化素、細胞壁水解酶、酰胺酶以及毒力調節因子等。根據其生物學特性和本中心實驗室檢測能力範圍，實驗室可能的感染因子為單核細胞增生李斯特氏菌病原體本身。 ^[3] 

單增李斯特氏菌的抗原結構與毒力無關，它的致病性與毒力機理如下：

1、寄生物介導的細胞內增生，使它附着及進入腸細胞與巨噬細胞； ^[2] 

2、抗活化的巨噬細胞，單增李斯特氏菌有細菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細胞內的過氧物（為殺菌的毒性遊離基團）分解； ^[2] 

3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養物上清液中獲得，為SH活化的細胞溶素，有α和β兩種，為毒力因子。 ^[2] 

單核細胞增生李斯特氏菌主要以食物為傳染媒介，是最致命的食源性病原體之一，造成二至三成的感染者死亡，其致死率甚至高過沙門氏菌及肉毒桿菌。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、捲心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染。約80% -90%的病例是由被污染的食品引起的。 ^[3] 

該菌可通過眼及破損皮膚、黏膜進人體內而造成感染，孕婦感染後通過胎盤或產道感染胎兒或新生兒。棲居於陰道、子宮頸的該菌也可引起感染。性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有上升趨勢。 ^[3] 

1.細菌培養法

該菌營養要求不高，兼性厭氧，最適在含有CO₂的微需氧環境中生長，生長温度範圍—1.5℃-45℃，最適温度為30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生長，是一種典型的耐冷性細菌，同時還具有耐鹽性。LM在普通瓊脂平板上呈細小直徑約0.2-0.4μm、半透明露水樣菌落。在血瓊脂平板上有β溶血環。在顯色培養基上呈藍綠色。 ^[4] 

食品中李斯特氏菌的傳統檢驗方法是進行前增菌或選擇性增菌，以分離培養得到的可疑菌落做生化反應實驗、溶血實驗、協同溶血實驗（CAM P）等免疫學檢測，被確定為李斯特氏菌後進一步進行血清分型。該方法中增菌和選擇性增菌是不可缺少的步驟。增菌的方法主要包括：冷增菌法和常温培養方法。冷增菌法是在4℃培養30d ，有時甚至長達一年。常温增菌需培養24h 至7d 。故傳統檢測方法需要7-11d 才能分離鑑定出李斯特氏菌，故傳統方法檢測週期較長。 ^[4] 

2.血清凝集法

根據菌體抗原和鞭毛抗原，LM分為16個血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。抗原結構與毒力無關，對人致病的主要為血清型1/2a、1/2b、4b，佔全球本病病例約90%。 ^[4] 

3.分子生物學檢測方法

隨着核酸探針雜交技術的應用，使對單核細胞增生性李斯特氏菌的檢測進入了分子水平。 ^[4] 

3 .1 　探針檢測技術

這一技術是最早應用於李斯特氏菌檢測的分子生物學技術。早在1988年，Atin 等就克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一個500bp DNA 片斷並測序，以此序列合成4種寡核苷酸探針，以³²P 標記該探針，經斑點雜交實驗證實，該探針只與李斯特氏菌反應，與其他種的李斯特氏菌和屬外的細菌均呈陰性，表現出很好的特異性。但探針雜交無法分辨死菌和活菌，儘管通過增菌可使死菌比例減少，相對地減少假陽性，但並不能完全杜絕假陽性結果。隨着探針技術的逐漸成熟，人們開始關注將多個DNA 特異性探針固定到芯片上，製成基因芯片。基因芯片的特點是可同時檢測多種菌，可以減少實驗次數，並且檢測所需的引物較少。 ^[4] 

3.2 聚合酶鏈式反應（poly merase chain reaction ，PCR）檢測技術

PCR 的發展已經相當成熟，廣泛應用於李斯特氏菌的檢測。PCR 擴增特異性引物一種是依據李斯特氏菌的特異毒力基因序列而設計，一種是依據李斯特氏菌基因組中特異序列而設計。常用的靶序列為hly A 、iap 、inl 、Dth-18等毒力基因。利用PCR 方法來檢測李斯特氏菌的優點是方法的特異性好，不足之處是靈敏度較低；將樣品培養物經化學抽提後再進行擴增，提高了樣品的檢出率；並且可以檢測到傳統增菌方法不能檢出的“活的非可培養”的李斯特氏菌。PCR 技術還可對李斯特氏菌進行定量檢測。例如Nogva 等運用5′-核酸酶PCR 對單增李斯特氏菌定量；Choia 等運用cPCR 對李斯特氏菌進行定量；Long 等以hly 為靶基因，採用PCRELISA聯合檢測技術。 ^[4]  。

單核細胞增生李斯特氏菌在一般熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競爭性細菌羣，使單增李斯特氏菌在沒有競爭的環境條件下易於存活，所以在食品加工中，中心温度必須達到70℃持續2min以上。單核細胞增生李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產品已經過熱加工處理後充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產品的二次污染，因此，蒸煮後防止二次污染是極為重要的。因為單核細胞增生李斯特氏菌在4℃下仍然能生長繁殖，所以未加熱的冰箱食品增加了食物中毒的危險。冰箱食品需加熱後再食用。如果是生魚片之類的海鮮，則專業酒店都會存放於零下40℃左右的大型冰櫃，以確保殺滅寄生蟲及防止病菌感染。 ^[3] 

單核細胞增生李斯特氏菌感染治療可用青黴素、氨苄西林、慶大黴素，紅黴素等。對青黴素過敏的可用紅黴素和其他廣譜抗生素。 ^[3] 

①單核細胞增生李斯特氏菌分離純化及保菌操作應在生物安全櫃內進行，若發生磁珠管破損、磁珠掉落時，應立刻對所涉及的器物進行消毒處理，並按《二級生物安全實驗室建設與管理》中“意外事故處理辦法章節規範”處置。 ^[3] 

②單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株的使用、保存嚴格按照《菌（毒）種管理規程》（ XJK/CX37）要求進行操作，嚴格實行雙人雙鎖保管，嚴防菌株被惡意使用而造成的生物危害。 ^[3] 

③在單核細胞增生李斯特氏菌陽性菌株在上送過程中嚴格執行B類運輸包裝（同“樣品採集”），攜帶“可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸許可證”，由專車運送，由專業人員全程護送。 ^[3]