HLA分型

HLA(humanleucocyteantigen)複合體是人類多態性最豐富的遺傳系統，定位於第6號染色體短臂6P21.31區，長3600kb。1999年已完成全部序列分析及基因定位，在此區域內共確認了224個基因座位中128個為功能性基因，其中39.8%和免疫功能相關。HLA基因根據其編碼分子的分佈與功能不同分為3個區，即Ⅰ類基因區，Ⅱ類基因區，Ⅲ類基因區。

HlA複合體中很多基因座位的DNA序列在人羣中存在許多變異體，即HLA含大量的等位基因。由於來自父母的兩條第6染色體所有的HLA等位基因完全相同的概率極小，這就使每一個體所具有的HlA等位基因及其產物具有該個體的獨特性。HLA等位基因頻率不僅在不同人羣、不同地域存在明顯差異，而且與某些疾病的發生存在一定的相關性。HLA分型為器官移植的供受者、選擇提供有效的手段，還應用於法醫學DNA分型和親子鑑定。因此，HLA分型不僅為了解人種來源和民族的遷徙提供重要的科學資料，而且在醫學實踐中有重要意義。但是，HLA高度多態性也為器官移植時尋找合適的供體帶來了很大的困難 ^[1]  。

HLA分型方法主要包括血清學分型和DNA分型。血清學分型技術側重於分析HA抗原的特異性，DNA分型方法則側重於分析基因本身的多態性。

1.血清學方法：1964Terasaki建立了HLA微量淋巴胞毒實驗方法來分析受試者的HLA型別，其主要過程是從全血或淋巴組織中分離出淋巴細胞，與HLA-特異性抗體包被的微孔板孵育，加入補體，使能與淋巴細胞表面HA抗原結合的特異性抗體通過經典途徑激活補體，導致靶細胞水解(淋巴細胞毒性)。多年來這種血清學方法是確定HA配型的重要方法，也是國際通用的標準技術。然而血清學方法存在諸多限制，如確定HLA特異性抗體需要做大量的篩查工作，一些HLA抗原很難用血清學方法鑑定；HLA的交叉反應影響了分型結果的準確性，給亞型的進一步確定帶來困難等。因此近年來更多采用的是HLA的基因分型方法1990年世界衞生組織WHO統一了HLA基因分型的命名以及與血清學分型的對應關係，使HLA的研究轉入基因水平的研究。

2.DNA分型方法：DNA分型主要分為兩種方法：基於核酸序列識別的方法和基於序列分子構型的方法，常用的方法大致可分為大類：

①限制性片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphism，RFP)。其原理是不同的DNA膜板山於序列的差異在限制性內切酶作用下將被切成大小不同的片段，其電泳遷移率也發生差異，經電泳分離、印跡、探針雜交等一系列技術處理來分析目的基因。

②聚合酶鏈式反應寡核苷酸探針雜交方法PCR-SSO(sequence specifie oligonucleotide，SSO)。原理是PCR基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑑定。

③聚合酶鏈式反應單鏈構象多態性分析(PCR- single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP)。PCR產物經變性為DNA單鏈，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，只有一個核苷酸發生變異，其電泳遷移卒就會改變，從而進行多態性分析。

④DNA序列測定(sequencing)。能直接讀到目的片段核苷酸的完整序列，重複性好，分辨率高，自動化程度高，是HA分型最直接、最精確、最可靠的方法。常用於對新發現的HLA特異性進行DNA序列分析。

⑤特異性引物PCR技術(PCR sequence- specific primer，PCR-SSP)。採用特異性等位基因引物作PCR，擴增得到的DNA片段因分子量的不同而被凝膠電泳方法區別。

以上HA分型技術各有其自身的特點：DNA測序測定的分型方法最直接、最精確、最可靠，常用於對新發現的HA特異性進行DNA序列分析，所需設備昂貴；採用PCR-RFLP、PCR-SSCP技術進行HLA分型則敏感性和精確性較高，檢測時間比較短，但方法學複雜；PCR-SSP和SSO技術具有高特異性與敏感性、簡捷、快速、結果容易判斷，是比較理想的高效檢測配型手段，其有相當的應用前景。

3.HLA交叉反應組(CRFG)：HLA基因分型的精確度明顯提高，大幅度減少了GVHD的發生率。但正是由於基因分型的精確，找到基因亞型完全相合的供體非常困難。同時臨牀資料顯示，同樣是供受者HLA錯配，有些錯配明顯影響移植物存活，而有些錯配並無顯著影響。因此，臨牀上需要種更為實用、臨牀可行的配型策略，即確定HLA雖不合但可以接受或可以允許的供者。抗原A、B、DR基因位點在形態學上有高度的多態性，但它們各自蛋白基因產物氨基酸殘基卻只有微小的差別。某些HA抗原在分子結構接近，具有公共抗原決定簇，可與某一抗體發生交叉反應。這些抗原被稱為交叉反應組(cross reactive group，CRFG)，而其根本區別在於氨基酸殘基不同。1996年Terasaki提出了新的配型策略――交叉反應組配型，又稱HLA氨基酸殘基配型ResM ^[2]  。

HLA系統研究從70年代到80年代末期主要是血清學研究，90年代以來，HLA進入了分子水平研究階段。HLA分型技術同樣走過了這一歷程。建立於60年代的血清學及細胞學分型技術主要側重於分析HLA產物特異性。1991年第11屆國際HLA專題討論上提出了HLA的DNA分型方法，隨着測序技術的突飛猛進，基於DNA序列的分型方法已經取代了傳統的血清學及細胞學分型方法。現DNA分型方法主要分為兩種：基於核酸序列識別的方法和基於序列分子構型的方法。基於核酸序列識別的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。其中PCR-SBT測序方法是現世界衞生組織（WHO）推薦的HLA分型方法的“金標準”。

採用序列特異性引物擴增HLA等位基因的特異性片段，經電泳分離，根據PCR結果的反應格局具判斷被測標本的HLA等位基因型，具有通量大、正確性好的特點。反映了HLA抗原水平的等位基因類型，用於骨髓、器官移植組織配型的初篩。

過去治療白血病通常是通過骨髓移植進行的，由於必須在麻醉狀態下抽取骨髓捐獻者的部分骨髓，整個過程對捐獻者產生非常大的心理壓力。現隨着科學進步，只需抽取若干毫升靜脈血，分離出幹細胞，再輸入患者體內即可。首先抽取患者和捐獻者的靜脈血樣本，提取DNA，測出各自DNA鹼基的順序，最後通過軟件比對分析得出HLA型別。HLA高分辨分型技術是世界衞生組織認定的HLA分型標準。分型的作用就是要找到排列一致的樣本，配型的精度決定了患者在術後的康復效果和生存質量。決定治療成本的關鍵步驟是如何快速、準確地找到與患者一致的幹細胞。

HLA高分辨分型技術與過去的低分辨相比配型速度更快，配型更精確，使得移植排斥反應更小，手術成功率和術後存活率更高。

隨着醫學的發展，像白血病、地中海貧血等能用最新的基因技術進行分型檢測，再尋找合適的供體進行移植治療。現通過HLA高分辨分型的外周血幹細胞移植技術能大大提高配型效果，使患者的康復更快，更有保證。

骨髓與器官移植是治療白血病、癌症等人類重大疾病的有效手段，而在移植過程中人類白細胞抗原（HLA），是決定移植排斥反應高低的重要因素。在進行骨髓和其它器官移植時，供者和受者之間人類白細胞抗原（HLA）相容程度越高，排斥反應的發生率就越低，移植成功率和移植器官長期存活率就越高；反之，就越容易發生排斥反應。雖然直系親屬間HLA完全匹配的概率較高，但是由於我國白血病患者多為獨生子女，在骨髓庫中尋找與患者HLA完全匹配的志願者，成為發現供者的主要途徑。

我國骨髓庫中的HLA分型數據多數是低分辨的，並不能確保供者和患者的HLA真正匹配，患者往往需要和多個低分辨匹配的志願者進行高分辨復核才能找到真正合適的供者。有的患者與數十個低分辨匹配的志願者進行復核後，發現他們均不是合適的供者，甚至有的患者只能在HLA部分匹配的情況下就進行骨髓移植，導致術後出現嚴重的排斥反應，需要服用大量藥物來維持生命。此外，高分辨率配型費用昂貴，如果捐髓者本人是中華骨髓庫的註冊志願者，捐者和患者一次高配的費用是7200元(每人3600元)，如果捐者不是註冊志願者，費用則是10000元（每人5000元），如此高的檢測費用患者通常難以承受。因此，必須儘快實現“高分入庫”，從根本上降低檢測費用，提高HLA配型效率。

為改變現今落後的HLA匹配手段，現通過高分辨分型的外周血幹細胞移植技術能大大提高配型效果，使患者的康復更快且效果更有保證。該方法應用新一代的測序技術，只需通過一次實驗就能夠讀取數千份樣本的HLA序列數據，並一次性達到HLA分型的最高分辨率，同時還可發現新的等位基因。在檢測通量、數據質量、成本控制等方面都有質的飛躍。應用這種新技術進行高分辨配型，成本不到傳統技術的一半，但真正做到了“低分價格，高分數據”，能避免多次配型給患者造成的額外經濟負擔，也為治療爭取寶貴的時間。

最新HLA高分辨分型技術，使建立高分辨HLA數據庫成為可能，不僅有利於快速準確地找到合適供者，大大地提高骨髓庫的使用率，使其更好的服務於患者，而且可以為HLA的科學研究與技術創新提供基礎性的數據支持。

地中海貧血治療

造血幹細胞移植異基因造血幹細胞移植是現能根治重型Β地貧的方法。如有HLA相配的造血幹細胞供者，應作為治療重型Β地貧的首選方法。

急性白血病，骨髓移植。

對ANLL療效較好。①同基因骨髓移植，供者為同卵孿生子。②同種異基因骨髓移植，供者為患者的兄弟姐妹。隨着醫學的發展像白血病、地中海貧血、腎衰等能用最新的基因技術進行分型檢測，再尋找合適供體進行移植治療。現今通過HLA高分辨分型的外周血幹細胞移植技術能大大提高配型效果，使患者康復更快，效果更有保證。

自體骨髓移植，不需選擇供者，易推廣。