HLA分型技術

HLA基因，位於6號染色體上短臂上，長約4000Kb。HLA是目前所知人體最複雜的遺傳多態性系統，有幾十個基因座位，每個基因座位又有幾十個等位基因，且呈共顯性表達。由於MHC基因位於同一條染色體上，其多基因座位上的基因型組合相對穩定，很少發生同源染色體間交換，這就構成了以單元型（HAPLOTYPE，即在同一條染色體上緊密連鎖的一系列等位基因的特殊組合）為特徵的遺傳。按中國人常見的A座位基因有13個，B座位基因有30個計算，可組成的單元型約有13×30=390種之多。理論上估計，父母各給一串單元型給子女，便會形成4.3萬種HLA－AB血型。事實上，HLA 各基因並非完全隨機組合。理論推測的HLA 分型數量巨大，但對一個具體的民族來説並非如此。世界上各個民族人羣的HLA多態性和單元型都有各自的特點。總體來講，中國北方漢族、北美白人和北美黑人人羣的多態性較中國南方漢族和日本人羣豐富。即使在中國，地區間也存在差異。在中國漢族羣體中抗原A1、A3、B13、B44和B51頻率呈北高南低分佈，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分佈。在中國漢族羣體中常見的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10單體型頻率呈北高南低分佈，在江浙滬漢族人羣中頻率較北方漢族人羣下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58-DRB1*13單體型頻率呈北低南高分佈。HLA多態性程度可見一斑。

HLA研究涉及免疫學、生物學、遺傳學、分子生物學、醫學等多個學科，並已發展成為一個獨立的學科分支。迄今HLA研究已達到相當深入的水平，並在諸多方面取得顯著進展，包括HLA複合體結構；HLA分子結構及其表達的調控；HLA分子功能，尤其是在抗原處理、呈遞及T細胞識別中的作用；HLA的DNA分型及多態性研究；HLA與疾病的關係；HLA與移植的關係等。HLA研究不僅使器官移植成為一種極有價值的治療手段，並給基礎與臨牀免疫帶來了突破性進展。已經證實，HLA複合體中存在控制免疫應答的基因以及HLA參與約束免疫細胞間相互作用，這表示HLA涉及生命活動的各個水平與多個方面。可以預期，對HLA的研究將繼續成為免疫遺傳學最活躍的部分；對HLA的應用將擴展到基礎、臨牀、預防醫學的各個領域。

縱觀HLA系統的研究過程，其發展無不與技術的手段的突破與運用有密切關係。70年代到80年代末期主要是血清學研究；90年代以來，HLA進入了分子水平研究階段，進展尤為顯著。HLA分型技術同樣走過了這一歷程。建立於60年代並不斷完善的血清學及細胞學分型技術主要側重於分析HLA產物特異性。

血清學分型藉助的是微量淋巴細胞毒試驗（microlymphocytotoxicitytest）或稱補體依賴的細胞毒試驗（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待測外周血淋巴細胞，作用後加入兔補體，充分作用後加入染料，，着染的細胞為死亡細胞，依據特異性抗體介導的補體系統對靶細胞溶解的原理，待檢淋巴細胞表面具有已知抗血清所針對的抗原。血清學分型存在諸多缺點：①標準分型抗體親和力較弱、效價較低、易產生交叉反應，②缺少某些單價抗血清；③某些病理過程可能導致外周血淋巴細胞表面抗原性質發生改變．干擾抗原—抗體反應；④國內供HLA—I類抗原分型的血清板來源困難、質量欠佳。上述因素均嚴重影響了HLA分型結果的可靠性及該技術的推廣應用。

細胞學分型技術指的是通過純合分型細胞（homozygote typing cell,HTC）及預致敏淋巴細胞試驗（primed lymphocyte test,PLT）對HLA分型。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細胞在識別非己HLA抗原決定簇後發生的增殖反應。由於分型細胞來源困難以及操作手續繁瑣，細胞學分型技術下正逐漸淘汰。

1991年第11屆國際HLA專題討論上提出了HLA的DNA分型方法，這類方法近年來在研究和應用方面發展非常快，有取代其他方法的趨勢。DNA分型方法主要分為兩種：基於核酸序列識別的方法和基於序列分子構型的方法。下面簡要的闡述各方法的原理和優缺點。

基於核酸序列識別的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。

PCR-RFLP：其原理是將目的基因片段PCR擴增後，利用多種限制性內切酶對擴增產物進行酶切，不同的基因序列會產生不同的酶切產物，從而產生不同的電泳圖譜。它以其簡單、敏感、準確，無需同位素等優點成為目前較常用的HLA基因分型技術之一，但是無法分辨雜合子，且只能區分有限的多態性。

PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）：也稱PCR-ASO（allele specific oligonuceotide）。用以同位素或非放射性標記的探針與PCR擴增的目標片斷產物雜交，根據陽性斑點判斷個體基因型。由於HLA等位基因非常多，就需要很多的探針對每個DNA樣品要進行多次雜交（甚至十幾次）才能完成定型分析操作也十分繁瑣。於是在此基礎上又發展起來一種反向雜交法（reverse hybridization）。將各種不同的探針固定於同一張膜上，再將PCR產物標記，以PCR產物（待檢測基因DNA）反過來與探針雜交。這樣一次雜交即可完成多個等位基因分析。此方法具有靈敏度、特異性強、需樣本量少等優點，但不同探針的雜交條件的須嚴格統一（如温度，離子強度）, 易出現誤差;不能檢測新等位基因，試劑盒需不斷升級; 對某些雜合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多態性，而僅僅由於排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01#113）。此方法適宜大量和高純度樣本，雜交條帶將作為書面原始記錄長期保存（三種效果比較）。

PCR-SSP：上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最終均需用標記的特性探針與擴增產物進行雜交，再分析結果。PCR/SSP方法用乃設計出一整套等位基因組特異性引物（sequence specific primer,SSP），藉助PCR技術獲得HLA型別特異的擴增產物，可通過電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡化了實驗步驟。優點是簡單易行, 分辨率可從低到高, 成本低 。缺點是不易自動化;不能檢測新的等位基因，試劑盒需不斷升級。此方法適宜零散和純度低樣本，重複實驗時要重提DNA和必須使用紫外凝膠成象儀保留原始資料，增加實驗成本（三種效果比較）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量試劑（引物）,且不能識別非經典的HLA基因和假基因（綠）。針對HLA外顯子和內含子序列精心設計引物可避免這些問題。

PCR-SBT: 以PCR擴增所要分析的基因片斷，然後對DNA序列進行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大規模進行，精確度高，能直接發現新的等位基因。但是由於雜合子的存在，無法分辨單元型。

以上各個方法都存在無法克服的缺陷，如能配合使用，則能大大提高分型能力。國外有學者對60個樣本進行研究，發現單用SBT，只有18%的樣本能將A，B位點同時分型成功，如結合SSO，則能將所有樣本成功分型。

基於核酸序列識別的分型方法始終無法越過雜合子的難關。HSE(Haplotype-specific extention)技術解決了這一問題。它是利用磁珠與其中一條同源染色體的特異位點結合，達到分離同源染色體的目的，雜合子問題不攻自破。因此，HSE無論與SSO還是SBT結合使用，都有極好的效果（1.01#12，4.01#94）。

近年來，測序新技術發展層出不窮，紛紛運用到HLA分型中。如MSNE(multiplex single nucleaotide extention),應用鏈中止法原理，根據等位基因SNP位點設計特異性引物和生物素熒光標記的ddNTP進行分型，有重複性好，可分辨雜合子等優點，已應用到A位點的分型中。（4.01#93）又如pyrosequencing 法分型，分辨率好，可分辨雜合子，自動化程度也高。DNA芯片技術，作為一項檢測SNP的成熟技術，也已應用到HLA 分型中.

基於序列分子構型的分型方法在理論上就避開了雜合子這個難題。SSCP(PCR單鏈構象多態性分析，PCR-single strand conformational polymorphism)是最常用的根據構型的分型方法。擴增的目標產物變形後形成單鏈，不同的序列，甚至僅有一個鹼基的差異，就會形成不同的莖環結構，從而電泳速率不同。但此方法僅限於分辨僅限於200－300bp（綠16），且即使是同一單鏈DNA在相同情況下也會形成不同的構型，使得電泳條帶很難分析;也有可能會出現當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小的情況,使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。

HA(異源二聚體電泳多態性，Heteroduplex Analysis)是另一種基於序列分子構型的分型方法，根據異源二聚體未配對區域的長度和分佈而顯示出電泳條帶不同（綠18）。但與單鏈DNA相比，異源二聚體電泳條帶過於複雜，難以分析。

新發展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技術根據HA的原理，設計了位點特異性熒光標記的參照DNA片段，與樣本DNA分子的正反鍊形成異源二聚體.帶有熒光標記的電泳條帶易於分析，能夠克服HA的不足。

另外，提取基因組模板的技術也在不斷髮展。用於分型的DNA來源也已不侷限於血液，口腔塗片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01#261）。針對微量基因組模板的情況，現已開發出基於滾環複製的全基因組擴增技術，可以將1ng的模板擴大至100ng，足以應付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技術的要求。