單鏈構象多態性分析

聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年來發展起來的一種基因分析方法。

PCR-SSCP分析的基本程序為：首先PCR擴增特定靶序列，然後將擴增產物變性為單鏈，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外，更主要的是取決於DNA單鏈所形成的構象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身摺疊形成具有一定空間結構的構象。這種構象由DNA單鏈鹼基決定，其穩定性靠分子內局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個鹼基不同，所形成的構象不同，電泳遷移率也不同。PCR產物變性後，單鏈產物經中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶DNA中含氮鹼基置換，或數個鹼基插入或缺失等改變時，因遷移率變化會出現泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區分開。由此可見，PCR-SSCP分析技術是一種DNA單鏈凝膠電泳技術，它根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。該技術已被廣泛用於癌基因和抗癌基因變異的檢測、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因製圖等領域。

為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結果，現已發展多種PCR-SSCP技術，各有其優勢及適用領域。例如，可以在PCR擴增中用同位素或熒光素等標記引物或核苷，也可以在電泳後用銀染或溴化乙錠染色以顯示結果。這裏將重點介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進行PCR擴增特定靶基因序列時，利用γ-32P-ATP標記引物或直接在PCR反應體系中加入α-32P-dCTP進行PCR擴增，使擴增產物帶有同位素標記物，然後將擴增產物變性為單鏈進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結果。利用引物標記或鹼基摻入法使PCR擴增產物帶有同位素標記物，均可使產物信號增強幾個數量級。二者相比較，前者經濟、擴增特異性強，多用於大樣本的檢測和篩選；後者操作簡便，適於一般實驗室開展，可用於小樣本或大樣本的檢測和篩查。

⒈　PCR相關試劑

⒉　α-32P-dCTP

⒊　30%聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺 1g，溶於100ml ddH2O中，4 OC保存。

⒋　10%過硫酸胺配製方法：1g 過硫酸胺，溶於10ml ddH2O中，4 OC保存（可用數週）。

⒌　TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）

⒍ 5×TBE緩衝液：Tris鹼54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。

7．變性上樣液：95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚藍、 20mM EDTA(pH 8.0)

⒈ PCR擴增

反應總體積為10μl，在0.5ml微量離心管中加入下列反應成分：

10×buffer 　 1μl

dNTPmix 　 70μM

DNA模板 100ng

引物及Taq DNA酶 依實驗設計要求按比例加入

α-32P-dCTP 　 0.1μl

加ddH2O至 　 10μl

按實驗設計循環參數進行擴增，獲取擴增產物。

⒉ 聚丙烯酰胺凝膠電泳

⑴ 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來水反覆衝淨洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，晾乾，95%乙醇擦拭，自然乾燥。用棉籤沾取SigmaCote塗於玻璃的貼膠面上， 5～10min後再用軟紙擦拭除去多餘的SigmaCote溶液。在兩塊玻璃內的兩側放好襯條對齊，用固定夾夾緊兩塊玻璃，並用玻璃膠帶封邊。

⑵ 制膠：按照被分離DNA片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積，一般來講使用5%～8%的凝膠較為合適。輕輕搖勻配製的膠液於真空抽氣（開始時要緩慢）除氣泡，加 35μl TEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混勻。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取膠液，將玻璃模具傾斜成60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應的點樣梳，（小心勿使梳齒下帶進氣泡，並且不要將梳齒全部插入膠內，留約2mm梳齒於玻璃板上端，以免拔梳時把膠孔拔斷）。由於凝膠在聚合過程中有回縮，所以應小心添加些膠液於梳子處，水平放置，室温聚合1hr。將封口玻璃膠帶掀去，放入電泳槽，凹型玻璃貼緊電泳緩衝液槽，用大號固定夾固定住兩側。在上下電泳槽內灌入 1×TBE電泳緩衝液。小心取出點樣梳，用槽內的緩衝液反覆沖洗點樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。

⑶ 擴增產物的處理：將 PCR擴增產物與變性上樣液按1：5的比例加入0.5ml　微量離心管中，混勻。樣品上膠前應98 o C變性10min，立即冰浴驟冷。取約3～5μl變性樣品（根據點樣孔的大小決定上樣量），以微量加樣器上樣，（上樣時要注意不要有氣泡衝散樣品，而且速度要快，時間長了樣品易於擴散）。

⑷ 電泳：電泳槽接上電極（上槽接負極，下槽接正極）開啓電源，根據擴增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時間。通常室温下以l～5V/cm電泳。

⑸ 剝膠：電泳結束後，倒棄電泳緩衝液，取下電泳膠玻璃，用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃，凝膠應附着在一塊玻璃上，切去凝膠左上角，作為點樣順序標記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙，嚴密覆蓋於凝膠上，順一個方向將凝膠緩慢取下，用保鮮膜蓋於膠面幷包好，避免膜和膠之間產生氣泡或皺摺，將凝膠固定在X線片夾中。

⑹放射自顯影：在暗室中將X線片貼於膠面，蓋嚴片夾，用黑布將X線片夾包裹，置-70OC放射自顯影。曝光時間根據同位素的強度而定，約 24h～10d。

⑺ 沖洗膠片從-70oC取出X線片夾，在暗室內迅速取出X線片，立即顯影，以免使X線片上出現過多的冷凝水。（如果想再得到一張放射自顯影影像，可立即在片夾中裝一張新X線片並儘快放回到一70oC繼續顯影。如果來不及再加入新片即已出現冷凝水則應使樣品凝膠和X線片夾都恢復到室温，並擦去冷凝水後再裝入新的X線片）。依次按以下程序操作進行顯影：

X線片顯影液顯影 1-5min

水洗 lmin

定影液定影 5min

流動水沖洗 15min

所有使用液的温度應為18～20OC為宜。

⒈ 核酸片段的大小: 用於SSCP分析的核酸片段越小，檢測的敏感性越高。對於500bp的片段，則僅能檢出10%～30%的變異，因此，

⒉ 遊離引物: 遊離引物可能同 PCR產物結合而改變其泳動率，即使遊離引物量為6nM都有明顯影響。因此，應儘可能除去遊離引物。可以採用不對稱引物擴增方法，儘可能消耗多餘的引物。也可以運用過柱或磁性球方法純化PCR產物。或者是稀釋PCR產物，減少遊離引物的干擾。

⒊ 低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑，如5%-10%甘油、5%尿素或甲酸胺、10%二甲亞碸（DMSO）或蔗糖等有助於提高敏感性，可能是因為輕微改變單鏈DNA的構象，增加分子的表面積，降低單鏈DNA的泳動率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此，對同一序列使用2～3種條件做SSCP，可能提高敏感性。

⒋ 電泳温度: 一般認為保持凝膠內温度恆定是SSCP分析最關鍵的因素，温度有可能直接影響DNA分子內部穩定力的形成及其所決定的單鏈構象，從而影響突變的檢出。室温下電泳適於大多數情況，但由於在電泳時温度會升高，為確保電泳温度相對恆定，應採取以下措施：減少凝膠厚度，降低電壓，有效的空氣冷卻或循環水冷卻等。

⒌ 凝膠的長度: 可用測序板進行SSCP分析，凝膠板長度在40cm以上。

⒍ 凝膠濃度及厚度: 凝膠濃度很重要，一般使用5%～8%的凝膠，凝膠濃度不同，突變帶的相對位置也不相同，如果在進行未知突變種類的SSCP分析時，最好採用兩種以上凝膠濃度，這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對SSCP分析也很重要，凝膠越厚，背景越深，在上樣量較多的前提下，儘量使凝膠越薄越好。

⒎ 假陰性: 一般認為，如沒有污染，PCR－SSCP分析不存在假陽性結果，但可能出現假陰性結果，後者是由於點突變引起的空間構象變化甚微，遷移率相差無幾所致，尤其是點突變發生在擴增片段的兩端時。如果有陽性和陰性對照，結果可以重複確定的突變帶是可信的，如果沒有陽性對照，應經測序來確定其是否為突變帶。由於PCR－SSCP的不足之處主要是可能檢出假陰性結果。應通過設置陽性對照，摸索電泳條件，假陰性結果在很大程度上是可以避免的。但對未知基因變異的檢測，假陰性結果就難以百分之百地消除。

8. 結果分析: 單鏈凝膠電泳時，互補單鏈遷移率不同，一般形成兩條單鏈帶。PCR產物進行單鏈凝膠電泳之前，通過加熱變性產生單鏈。如變性不徹底，殘留雙鏈亦可形成一條帶．因此，PCR－SSCP分析結果至少顯示三條帶。但是，由於一種DNA單鏈有時可形成兩種或多種構象，檢出三條或四條單鏈帶就不足為奇。