雙縮脲反應

在鹼性溶液（NaOH）中，雙縮脲（H₂NOC-NH-CONH₂）與銅離子（Cu²⁺）作用，形成紫紅色絡合物（該物質的分子結構式見圖），該反應即雙縮脲反應。

銅溶液作用，就會形成紫色或藍紫色絡合物。

注：除-CO-NH-有此反應外，酰胺基（-CO-NH₂）、亞甲基（-CH₂-）、亞氨基（-NH-）、（-CS-CS-NH₂）等基團亦有此反應。值得注意的是，發生雙縮脲反應，一般需要含有兩個或兩個以上的肽鍵（-CO-NH-），或與它類似的結構，二肽不能發生雙縮脲反應 ^[1]  。例如，甘氨酰甘氨酰甘氨酸（Gly-Gly-Gly，一種三肽，含有兩個肽鍵）和雙縮脲（biuret）結構相似，可以發生（positive response）雙縮脲反應；而甘氨酰甘氨酸（Gly-Gly，一種二肽，含有一個肽鍵），不能發生（negative response）雙縮脲反應（圖1）。

由於蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能與銅離子在鹼性溶液中發生雙縮脲反應，且顏色深淺與蛋白質的含量的關係在一定範圍內符合比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子量無關，故可用雙縮脲法測定蛋白質的含量（藉助分光光度計可減小誤差）。

雙縮脲反應主要涉及肽鍵，因此受蛋白質特異性影響較小。且使用試劑價廉易得，操作簡便，可測定的範圍為1～10mg蛋白質，適於精度要求不太高的蛋白質含量的測定，能測出的蛋白質含量須在約0.5mg以上。雙縮脲法的缺點是精確度低、所需樣品量大。干擾此測定的物質包括在性質上是氨基酸或肽的緩衝液，如TrIs緩衝液，因為它們產生陽性呈色反應，銅離子也容易被還原，有時出現紅色沉澱。

雙縮脲試劑由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配製而成，配製比例為5：1。但是雙縮脲試劑不用現配現用，可以在蛋白質溶液中先加入NaOH營造鹼性環境，再加入CuSO4。這是與斐林試劑不同的地方。