雙標水法

在營養代謝研究中,穩定同位素常被用作示蹤劑來描述營養物質被攝入體內以後所經歷的代謝動力學過程,最常用的穩定同位素包括15N、 13C、 2H、18O、 42Ca、 44Ca等等 ,其中雙標記水 (2H218O)常用來作為能量代謝的示蹤劑。

雙標記水中的穩定性同位素2H和18O丰度遠高於自然界中水的丰度 (水中天然丰度:2H 0 . 015%,18O 0 . 204% ) ,當受試者攝入一定量的雙標記水(2H218O)後 ,機體即被這兩種同位素所標記。 2H參加水的代謝,其速率常數 KD 反映水的代謝率rH2O;18O既參加水的代謝 ,又參加 CO2 的代謝 ,由於碳酸酐酶的催化作用使得18O在 H2O和CO2之間處於反應平衡 ,其速率常數 KO 反映水的代謝率rH2O和 CO2 的代謝率或生成率 rCO2 ,當 H2O和CO2 反應平衡時 , KO - KD 可得到 CO2 的生成率rCO2。通過呼吸商 (Res p irat ory Quotient, RQ)和得到的 CO2生成率可算出 O2 消耗量 ,最後利用經典的 Weir公式[ 6 ]就能計算出單位時間內平均能量的消耗量。

國際上主要重氧水 (H218O)的生產廠家有:美國 Cambridge Is ot ope Laborat ories, Inc (簡稱: C I L) ;Sigma2 Aldrich Corporati on等。其中 ,美國劍橋同位素實驗室公司是全球最大的醫用18O同位素分離單位 ,年生產能力為 250 kg,並通過 G MP和美國 FDA認證 ,重氧水的規格分別有: 10 . 0 at om%、 9510 at2om%和 97 . 0 at om%。國內僅有極少生產廠家報道生產重氧水 (H218O)產品:上海化工研究院採用“ 水精餾路線 ” ,生產 3種規格的重氧水 (H218O)產品:10 . 0 at om%、 95 . 0 at om%和 97 . 0 at om%;江蘇華益埃索托普公司採用高效的精餾分離技術 ,可根據不同用户的要求提供 2%～97%各種規格的重氧水以及雙標水 ,年生產能力達 100 kg。

雙標水一般採用口服的方式給藥 ,事先按照一定的比例配製 ,消毒滅菌後用於人體。目前雙標水的應用劑量為:

2H (0 . 05 ～0 . 70) g/ kg T BW (TotalBodyWater) ,18O ( 0 . 12～0 . 40) g/ kg T BW,未成年人劑量要稍微高於成人。二者的濃度沒有嚴格的比例限制 ,以同位素測試儀器的精確度為準。同位素的劑量與同位素丰度測試的誤差有關 ,劑量大 ,費用增加 ,劑量小 ,精度低於 5%。根據以往的研究經驗 ,2H和18O的最適同位素劑量見表 1。

實驗週期與同位素的生物半衰期有關 ,實驗期過短 ,同位素丰度值變化太小增加偏差;實驗期過長 ,後期樣品的同位素丰度接近本底值增加測量誤差 ,通常收集時間為 1～3周 ,最適實驗週期見表 1。雙標水法收集的樣品可以是尿液、 唾液或者血液 ,通常樣品為尿液 ,嬰兒可收集唾液或尿液。樣品收集有多點法和兩點法 ,多點法是指收集全實驗過程的樣品並分析 ,兩點法是指只收集實驗開始一天和結束一天的樣品並分析 ,大多數情況下 ,兩種方法都能得到正確的結果 ,但在某些特殊情況下每種方法都有其優點和缺點[ 7—9 ]。收集到的樣品分裝於密封管中 , - 20℃冰箱保存備用。

樣品經過預處理 ,採用氣體同位素比質譜儀( Isotope Rate Mass Spectr ometer, I RMS)進行測定 ,得到樣品的δ 18O和δ 2H。上海第二醫科大學羅偉等[ 10 ]用雙標水示蹤法測定 13例正常成年人的能量消耗 ,首次在國內建立了雙標水樣品測定方法 ,尿樣雙復管測定的平均 CV%小於 1% ,最大不超過215%。得到樣品δ值後 ,結果計算參照以下步驟。

(1) δ值的修正 　實驗測得的各時間點18O和2H的δ值首先要使用下面的公式進行修正 ,換算成百分數

x = ( ( dpost - dp re ) / ( ddose - dtap ) ) ×(18 . 02a /WA )

x為18O或2H的丰度; dpost為樣品的丰度比值(相對於工作標準的比值 δ‰) ; dp re為口服雙標水前 ,基線樣品的丰度比值 (相對於工作標準的比值δ‰) ; ddose為稀釋後雙標水的丰度比值 (相對於工作標準的比值δ‰) ; dtap為現場自來水的丰度比值 (相對於工作標準的比值δ‰) ; a為分析用雙標水重量( g) ;W為稀釋口服雙標水所用的重量 ( g) ; A為口服雙標水的重量 ( g)。

(2) 同位素消除曲線的繪製 　分別用樣品18O和2H的丰度值取自然對數為縱座標 ,以時間為橫座標作圖 ,分別得到兩條直線 ,即為同位素的消除曲線 ,見圖 1。 18O和2H的速率常數分別為各自消除曲線的斜率 KO 和 KD。由兩條消除曲線反推到 t = 0,得到截距 ,把截距反對數後再取倒數 ,得出 NO 和ND ,它們分別代表18O和2H代謝池的大小 ,二者的比值應在 1 . 015 - 1 . 06之間。

(3) CO2的產生速率 　由同位素的消除曲線 ,可以得到18O和2H的速率常數 KO 和 KD 以及18O和2H代謝池的大小 NO 和 ND ,從而得到 CO2的產生速率。由於尚需考慮標記水分子的分餾因素而加入校正因子 ,因此實際計算用的公式各家報道不盡相同 ,目前國內外文獻中常用的是 Speakman mod2el

[ 11 ],它是在 L ifs on model[ 4 ]和 Schoeller model[ 12 ]的基礎上 ,綜合了 161份雙標水測定數據得到的 ,根據Speakman model算出 CO2的產生速率。

rCO2 = (N /2 . 196) ×( Ko - 1 . 0427KD )。

其中 ,N = (N o +ND /1 . 042 7) /2。

(4) 呼吸商 (RQ) 　呼吸商是指一定時間內機體 CO2產量與 O2消耗量的比值 , RQ隨着受試者攝入的混合食物中蛋白質、 脂肪、 碳水化合物的比例不同會產生 0 . 7～1 . 0的變化。當受試者處於熱量平衡狀態 (體重恆定 )時 ,可用食物商 ( Food Quo2tient, FQ)代替 RQ,食物商 ( FQ)可由實際攝入的食物組成計算得到[ 13—15 ]。已知食物商 FQ和 CO2 生成率 rCO2 ,則 O2的消耗速率 r O2 = rCO2 /FQ。

(5) 總的能量消耗 ( TEE) 　最後 ,總的能量消耗可以依據經典的 Weir公式計算得到。

TEE = 3 . 941 ×r O2 + 1 . 106 ×rCO2 - 2 . 17 × UN

(UN為每天的尿氮量 g/d)

首先 ,雙標水法測定結果準確 ,與常規的能量代謝測定方法相比 ,其精確度 (2%～8% )和準確度(1%～3% )都比較高 ,被稱為能量代謝測定的金標準[ 16—20 ]。其次 ,雙標水法基本不干擾受試者的一切正常活動 ,它測定的是人體在自由活動情況下的能量消耗 ,與實際情況更為接近 ,可以實現對不能合作者及活動不應受限制者的能量消耗的測定。最後 ,雙標水法無毒、 無損傷 ,它使用的示蹤物2H和18O是無放射性的穩定同位素 ,對人體無害;樣本的收集過程較為簡單 ,僅收集尿液來計算體內同位素的殘留量 ,對人體無創。此外 ,雙標水法在測定能量代謝的同時 ,可以評價總體水及體成分。

首先 ,雙標水法實驗費用昂貴 ,不僅試劑雙標水價格昂貴 ,而且測試需要靈敏度和精確度較高的同位素質譜儀和高技術素質的分析人員 ,這限制了此方法在營養科學和流行病學大樣本人羣中的應用。其次 ,雙標水法只能測定人體總的能量消耗量 ,它是對某時間段內尿液中的穩定同位素進行分析 ,只能獲得這一時間段內總能量消耗方面的信息 ,難以瞭解每天或每小時的能量消耗模式。最後 ,雙標水法還存在分析準確性上的缺陷。因為雙標水法是建立在一些假設和理想條件下的 ,當應用於實際環境時容易產生誤差 ,需要進行相應的校正。在理想條件下 ,2H只以水形式代謝 ,18O也只以水和二氧化碳形式代謝 ,但實際上機體組織會發生同位素捕獲或者交換。例如 ,合成脂類時有2H的摻入 ,同位素還會以尿素、 碳酸氫鹽等非水的形式排泄。當受試者的體重在研究期間發生變化時 ,這種現象造成的誤差會很明顯 ,導致低估能量消耗。但如果機體處於穩定階段 ,這種誤差則可以忽略[ 21 ]。

用雙標水測定動物能量消耗率的方法由Lifson[ 4 ]等始創於 20世紀 50年代 ,最初的研究主要侷限於小動物。直到 20世紀 80年代才開始應用於人體研究。其主要原因是18O的價格昂貴 ,當時每公斤體重所需的同位素價格為 1 500美元。後來 ,隨着生產同位素的成本下降 ,特別是由於高靈敏度和高精確度的同位素比質譜儀 ( Is ot ope Rate Mass Spec2trometer, I RMS)的應用 ,使得同位素的用量大大減少 ,從而費用降低 ,才有可能將此方法推廣到人體。採用雙標水法對人體活動時的能量消耗進行測定最早見於 Schoeller和 Van Santen的研究[5 ],它是一種能夠準確測量人體在日常生活和工作中總能量消耗的能量代謝測定方法。

雙標水法目前已廣泛應用於不同人羣能量消耗的研究 ,如早產兒、 兒童、 艾滋病人、 肥胖人羣、 孕婦、 哺乳期婦女和老年人 ,這些人羣如果採用其他能量測定方法則會遇到很多問題。譬如 ,以往因檢測方法的限制 ,研究嬰兒能量消耗很困難 ,只有在睡覺時才能較容易測定。現在由於雙標水法的優勢 ,使這方面的研究有了很大進展[ 22—24 ]。國內也開展了這方面的工作 ,廣東中山大學蔣卓勤等用雙標水法對 4月齡或 6月齡嬰兒的能量需要量進行了研究[ 25 ];中國疾控中心王京鍾等用雙標水法測定了54例 4月齡和 6月齡嬰兒的體成分[ 26 ]。近幾年雙標水方法在成人和兒童肥胖、 慢性病等流行病學方面的研究成果也引人關注[ 27, 28 ],這些研究充分顯示了該法的突出優點 ,即對不能合作者及活動不應受限制者的能量消耗的測定。

利用雙標水方法的準確性 ,以雙標水法為參照來評定其它能量代謝測定方法的有效性和可靠性 ,有關這方面的報道很多[ 35—39 ]。如美國約翰 ·霍普金斯學院 Joan等[ 40 ]將“7日體力活動回顧問卷法 ”與雙標水法做了比對研究 ,結果表明體力活動問卷能夠較為準確地評估個體總能量消耗 ,但是需要良好的個體依從性及嚴格的督導。國內關於這方面也有報道 ,如中國疾控中心劉愛玲等[ 41 ]應用雙標水法對加速度計 (CSA) 測量成人日常體力活動的效

度進行驗證 ,結果表明兩者測得的能量消耗值存在顯著的正相關關係 (R = 0 . 31, P ＜ 0 . 01)。

WHO的報告建議[ 43 ],各國應儘可能以實際測定的能量消耗量為基礎 ,來確定人體的能量需要量。制定能量需要量應以準確的能量消耗測定值為基礎。因此 ,雙標水法在制定新的能量推薦需要量中發揮了重要的作用。目前 ,西方國家已經積累了大量的人體能量代謝數據。Black等[ 45 ]收集了12年中 576例關於雙標水的研究 ,結果顯示美國於1989年制定的能量攝入標準中 ,嬰兒和兒童的偏高 ,而青少年和成年人的偏低。Davis[ 46 ]綜述了雙標水研究中 400多個嬰兒的資料 ,認為目前對 1週歲內嬰兒能量攝入的推薦值比用雙標水法測定的能量消耗值高 10 %Bandini[ 47 ]等對 109名 ( 8～12)歲兒童的研究發現 ,他們的平均能量消耗比Black等的評估要高 ( 100～200 ) kcal / d。Bratter2by[ 48 ]等對 46名青春期少年的研究與 B lack等的評估基本相符。Car penter等[ 49 ]對 164名 (65～70)歲的老年人的研究資料顯示 ,男性受試者能耗量與Black的評估值基本相符 ,而女性受試者的能耗值與 Black結果有較大差距。這些人體能量代謝數據對於 RN I的修訂和補充具有重要的參考價值。在我國 ,有關這方面的報道很少。目前 ,只有中國疾控中心姚漫江等與美國 Tufts大學合作[ 50 ],以 (35～49)歲北京市民為受試對象 ,用雙標水法測定了其日常活動能量消耗。對於我國能量 RN I的進一步修訂 ,則需要更多、 更新的中國人的實測數據來支持。

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